蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤.docx

蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤 蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤 一、注意事项： 盐析的成败决定于溶液的 pH 值与离子强度，溶液 pH 值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。 盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一 般先磨碎，平铺放入烤箱内 60 摄氏度烘干后再称量，这样 更准确。 在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来 速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其 完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失 活。 盐析后最好搅拌 40 分钟到一个小时而且再在冰浴中 放置一段时间。 3.5 为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理 后再测酶活性。 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析 较慢，一般可用超滤或者 G-25， G-50 处理。 一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在 70%左右。 二、实验步骤： 蛋白质盐析常用的中性盐， 主要有硫酸铵、 硫酸镁、 硫酸 钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，由下表 可以看出：它的优点是温度系数小而溶解度大 (20 度时饱和 溶液为 754 克/ 升;0 度时饱和溶解度为 706 克/ 升） ，在这一 溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来 ; 另外硫酸 铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸 铵溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之间，当用其他 pH 值进行盐析时， 需用硫酸或氨水调节。 表 1 几种盐在不同温度下的溶解度 （ 克 /100 毫升水 ） oc 20 C 80 C 100 C （NH4）2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 饱和硫酸铵法： 取 x ml 血清加 x ml 生理盐水，于搅拌下逐滴加入 2xml 饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为 50%。 4 C, 3h以上，使其充分沉淀离心 （3000rpm）,20min, 充上清，以 xml 生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵 x/2ml 。 置4C 3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为 33%] 重复上述第二步过程1?2次。末次离心后所得沉淀物为蛋 白，以 0.02%mol/L pH7.4PBS 溶解至 xml 装入透析袋。 对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液 无黄色，即无NH4+为止。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要 将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液 装入透析袋内 （常用的是玻璃纸 ），用缓冲液进行透析，并不 断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中 进行。此外也可用葡萄糖凝胶 G-25 或 G-50 过柱的办法除盐， 所用的时间就比较短。