【课件-实用生物医学实验技术】_Western blot 技术原理、常见问题及解决方案.pptVIP

此法的不足之处： 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。 Bradford法由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用 ： 1.灵敏度高：可精确定量 1～1000 μg/ml 的蛋白样品。 2.测定快速、简便：只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。 1 小时内吸光度变化不超过10%。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 3.干扰物质少：如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 注意事项 1．制作的BSA标准曲线如不规律，应重新再做。 2．如果待测样品浓度高（如组织提取物），可用生理盐水稀释10～20倍后再测定；如样品浓度低，可适当减少稀释倍数。使测得的OD值落在标准曲线范围之内。 蛋白样品的变性 2×SDS上样缓冲液： DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。 按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量30～60μg。 1M Tris-HCl(pH6.8) 10 ml 1M DTT 20 ml SDS 4 g 甘油 20 ml 溴酚蓝 0.2 g 总体积 100ml 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT 4%SDS 0.2%溴酚兰 20%甘油 ddH2O * SDS(十二烷基硫酸钠 )： 阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。 不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 * 凝胶成分 丙烯酰胺和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺 ?神经毒素！ SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED ??神经毒素！ 过硫酸铵(AP） ??神经毒素！ Tris-甘氨酸电泳缓冲液 * 注意事项 1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性???并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量或配胶时应戴手套及口罩 2.过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制 3.溶液中一旦加入TEMED，应立即混匀并快速灌注入玻璃夹槽中 4.为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的1×蛋白质电泳上样缓冲液 5.正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证蛋白由上向下方向电泳 凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD) 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5.0 57-212 灌制分离胶 隔绝空气 ddH2O 0.1%SDS:8% 异丁醇：8% * 灌制浓缩胶 插入梳子 * 浓缩胶 分离胶 样品 加样槽 蛋白质分子的迁移方向 * 电泳 采用恒压的方法：1.恒压80V，至样本跑过 浓缩胶；2.将电压调至120V至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，准备进行转膜。 1 2 3 M 电泳之后凝胶染色扫胶 注意： 做western blot通常用预染maker！ * 转膜 转膜现有两种方法： A. 半干转：采用恒流的方法，按照1mA/ cm2计算总电流量，时间约为25-60min。（本法多使用NC膜） B. 湿转法：采用恒流的方法，横压100V，1-2小时本法多使用PVDF膜，本法会产生大量的热量，且对温度敏感度较高，需用大量冰块降温） 转一张膜需准备6张滤纸和1张转印膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。转膜前，转印膜以及滤纸均需浸润在电转液中活化15-20min（其中PVDF膜需在无水甲醇中活化5-10min后再浸润于电转液中，且滤纸应与胶和膜的大小一致）。 将玻板轻轻撬开，将凝胶剪裁后从玻板上移至电转液中。从阴极到正极，按照三层滤纸 凝胶 转印膜 三层滤纸的顺序制成“三明治”（如为湿转，应在三明治的两侧各加一层活化过的海绵，同时应注意去除膜、凝胶和滤纸之间的气泡，且两侧的滤纸不能相搭，避免短路引起转膜不全）。 将制好的三明治放入电转槽中，注意正负极的方向，凝胶侧为负极，转印膜侧为正