DNA扩增片段长度分型技术标准.docVIP

PAGE PAGE 6 DNA扩增片段长度分型技术标准 1 主要试剂 Multiplex-1 Primer Mix Multiplex Buffer (10x) dNTPS(10x) Taq Polymerase 40% Acrylamiole:bis(19:1) 5×TBE Buffer TEMED 10% Ammonium Persulfate 2 主要仪器 DNA扩增仪（PE 9600） 旋涡混合器 干热器 微型高速离心机 电泳仪 3 操作步骤（本技术适用于STR，VNTR位点分型） 3.1 提取的DNA定量 配制0.8%琼酯糖凝胶 Agarose 1.2g 1×TBE Buffer 150ml 2)将标准含量（30ng/ul、20ng/ul、10ng/ul、5ng/ul）的DNA样品和可见性DNA参照物置于干热器孵育5分钟，稍离心。 3）将已制好的凝胶放入电泳槽，使电极液在胶上1cm左右。 4）将可见性DNA参照物及用作定量尺度的标准量的DNA各10μl及待测DNA样本按从左向右方向依次加入胶中。 5）150v电泳30分钟，加10μlEB染色30分钟。 6）将胶置于紫外分析仪上，观察结果并照像。与标准品作对照，推算标本DNA量。 三个STR位点PCR扩增 引物序列 引物由LIFECODES公司合成，引物序列如下： D12S1090位点：5’-CCCTAGTGGATGATAAGAATAATCAGTATG-3’ 5’-GGACAGATGATAAATACATAGGATGGATGG-3’ D3S1744位点：5’-ATGCCATGCAGATTAGCATT-3’ 5’-GAGGTTGCACTCCAGCCTGG-3’ 在D18S849位点：5’-TTTTTGTATTTCATGTGTACATTC-3’ 5’-CGTAGCTATAATTAGTTCATTTTC-3’ 3.2.2 PCR扩增 1）将模板DNA样品约5ng和DNA阳性参照物2.5μl分别加入标记好的0.5ml薄壁扩增管内。 2）每步加样均应考虑到在转移过程中可能的损耗。在超净工作台中配制扩增反应物（注意：所在成分贮于冰上进行）； 2.5μl 10×PCR Buffer 2.5μl 10×dNTPS 2.5μl Primer Mix 0.125μl(0.625 Units)Taq Polymerase 0.125μl Taq Mgcl2 Buffer Nuclease free Water→25μl 加扩增反应混合物到每个样品扩增管中。盖紧扩增管盖，混匀，放进PE9600型扩增仪中。 3）设计三个STR位点热循环参数为： 95℃预变性10分钟；95℃1分钟，65℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共30个循环周期；72℃保持10分钟；4℃贮存。 4）从扩增仪中取出已扩增样品，贮存于4℃冰箱，注意与未扩增样本和试剂分开放置。 3.2.3 扩增DNA样本检测 1）配制2%琼脂糖凝胶 Agarose 3g 1×TBE Buffer 150ml 于微波炉中煮沸熔化使透亮，冷却至60℃时灌入凝胶槽中。 2）将标准DNA分子量Marker和可见性DNA参照物置于干热器孵育5分钟。 3）将已制好的凝胶放入水平式潜水电泳槽，使电极液在胶上1cm左右。 4）将DNA分子量Marker和可见性DNA参照物及待测扩增样本与上样缓冲液（loading buffer，溴酚兰-二甲苯青兰）混合后，按从左向右方向依次加入琼脂糖凝胶加样槽中。 5）150V电泳45分钟，加15μl EB染色30分钟。 将凝胶置于紫外分析仪上，观察结果并照像。与标准品对照，观察扩增情况。 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 注意事项： 1）丙烯酰胺为神经剧毒和可疑致癌物，实验过程中应穿工作衣，戴手套及眼罩并加倍小心。 2）Sigmacote可经呼吸道吸入或经皮肤吸收对人体有害，TEMED可引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激反应，甲酰胺也可引起一定程度的皮肤刺激。接触这些试剂时应在通风处并注意戴手套及眼睛护罩。 3.3.1 准备制胶玻板 用Bind-Silane处理大玻璃板，使凝胶与之粘贴；用Repel-Silane处理小玻璃板，使凝胶易于剥离。通常分离放置两块玻板以免交叉污染，在两块玻板外缘刻划标记以区分未经处理的一面。 1）用95%乙醇清洗玻璃板。 2）处理小玻板：加3ml Repel-Silane于小玻板未刻标记的一面，用特制纸巾将其均匀涂抹在整个表面。室温干燥5分钟，用纸巾擦去多余的Repeo-Silane，去离子水浸泡玻板60分钟。在去离子水中用纸巾清洗玻板三次，再使之凉干，然后用95%乙醇清洗备用。 3)处理大玻板：在通风橱中准备Bind-S