大熊猫源轮状病毒重组蛋白VP6-VP7与壳寡糖化学结合疫苗的免疫原性研究.pdfVIP

摘 要 轮状病毒（Rotavirus,RV）能够引起人和多种幼龄动物的传染性及顽固性腹泻， 导致幼龄动物出现较高的死亡率。目前，对于大熊猫轮状病毒性腹泻的预防主要依靠 加强饲养管理，但是效果并不理想。因此，免疫预防是预防该病最为有效的措施。壳 寡糖（Chitosanoligosaccharides,COS）具有良好的生物相容性和较好的可溶性，能够 起到免疫调节作用且具有免疫增强活性。传统疫苗主要是将疫苗中的抗原与佐剂简单 的物理混合，但是将抗原与佐剂通过化学结合的方法连接成一个整体可以更大程度的 增强疫苗的免疫原性。本研究将大熊猫源轮状病毒（GiantPandaRotavirus，GPRV） 的重组蛋白VP6-VP7 与壳寡糖结合在一起，通过动物实验来评价该疫苗对体液免疫 和细胞免疫的影响。本论文的主要研究内容如下： 1. 利用同源重组的方法构建表达载体 pET21b-MPB/GST/EDA-VP6-VP7 、 pET21b-EDA-VP6、pET21b-EDA-VP7 根据GeneBank 中大熊猫源轮状病毒CH-1 株VP6 和VP7 的基因序列，分别设计 含有相应同源臂的引物，经过RT-PCR 扩增分别得到VP6、VP7、VP6-1、VP7-1 基 因序列，将双酶切后的表达载体与相应的片段进行同源重组反应，转化至DH5α后， 测序鉴定得到正确的表达载体pET21b-MPB/GST/EDA-VP6-VP7、pET21b-EDA-VP6、 pET21b-EDA-VP7。 2. 大熊猫源轮状病毒相关重组蛋白的诱导表达、纯化以及蛋白活性分析 将构建完成且测序正确的三个表达载体转化至Rosetta （DE3）中，将表达效果最 好的Rosetta （DE3）-pET21b-EDA-VP6-VP7、pET21b-EDA-VP6、pET21b-EDA-VP7 进行大批量的诱导表达，然后利用Nie-Agrose来纯化重组蛋白VP6-VP7、VP6和VP7， 并用TEV 蛋白酶来切除促融标签；另外，将纯化得到的重组蛋白VP6-VP7、VP6 和 VP7 进行Westernblot 分析得到其都具有生物学活性。 3. 大熊猫源轮状病毒重组蛋白VP6-VP7 与壳寡糖化学结合疫苗的构建 GPRVVP6-VP7-壳寡糖化学结合疫苗制备完成后，通过分析型凝胶层析、多糖蛋 白比率和核磁共振氢谱的测定来验证结合疫苗的偶联效率，结果表明VP6-VP7-壳寡 糖成功偶联；利用圆二色光谱来鉴定化学结合物中重组蛋白的结构特征，结果表明化 学结合物中重组蛋白VP6-VP7 的二级结构没有发生改变。 I 4.大熊猫源轮状病毒重组蛋白VP6-VP7-壳寡糖化学结合疫苗的免疫原性 将GPRVVP6-VP7-壳寡糖化学结合疫苗免疫小鼠，在免疫实验完成后测定小鼠 血清相关抗体，同时测定相关细胞因子；用MTT 法检测脾脏淋巴细胞的增殖。结果 表明，VP6-VP7-壳寡糖化学结合组免疫小鼠血清中IgG 抗体水平显著高于对照组 （p0.05），但是该组所产生的IgG 抗体水平的稳定性要比氢氧化铝胶佐剂组好，而 且该组IgG 抗体含量与氢氧化铝胶佐剂组相比差异不显著（p0.05）。VP6-VP7-壳寡 糖化学结合组中IgA 抗体水平显著高于其他免疫组（p0.05）。MTT 法检测脾脏淋 巴细胞的增殖结果为VP6-VP7-壳寡糖化学结合组和佐剂组所测结果与其他组相比差 异显著（p0.05）。测定免疫小鼠血清中IL-2、IFN-γ含量后得出，VP6-VP7-壳寡糖 化学结合组血清中IL-2、IFN-γ含量均显著高于对照组（p0.05），并且该组所产生 的IL-2、IFN-γ的稳定性要好于氢氧化铝胶佐剂组；同时测定免疫小鼠血清中IL-4、 IL-5 含量后得出，VP6-VP7-壳寡糖化学结合组血清中IL-4、IL-5 含量均显著高于对 照组（p0.05），并且该组所产生的IL-4 稳定性要好于氢氧化铝胶佐剂组。综合以上 说明VP6-VP7-壳寡糖化学结合具有良好的免疫原性；VP6-VP7-壳寡糖化学结合组小 鼠注射部位没有产生肉芽肿、溃疡，组织病理形态分析显示注射部位没有出现任何病 理变化。 综上所述可以得出GPRVVP6-VP7-壳寡糖化学结合疫苗具有良好的安全性、稳 定性和免疫原性，该研究为GPRV亚单位疫苗的研究提供了参考。 关键词：轮状病毒；VP6-VP