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本课内容 蛋白质的产率问题 蛋白质工程概要 蛋白质工程的应用实例 蛋白质的产率问题 • 在基因工程菌株中，影响外源蛋白质产率的因素包 括载体相关因素和宿主相关的因素。 • 与载体有关的因素主要有： ① 表达载体拷贝数的调控 ② 启动子的强弱与转录调控 ③ 转录终止子的效应 ④ 密码子的使用频率 ⑤ 信号肽的特征与分泌调控 • 影响产率的宿主因素主要有二：①mRNA 的稳定性； ②宿主的蛋白质降解系统。 载体拷贝数 • 通过调控基因拷贝数来提高外源基 因表达产量被称作‘基因的剂量效 应 ’，是一个对生产过程产生较大 影响的因素。 • 在多数情况下可以理解为质粒拷贝 数的多少，与ori有关。在克隆实验 ampr 中常使用拷贝数~100的多拷贝质粒。 lacZ’ • 在以E. coli 为宿主的生产中，常使 用可以根据培养温度调整拷贝数的 复制起点ori runaway质粒（如pCP3 ），42 ℃ 时 拷贝数最高可达几千个。 启动子的强度 • 启动子的强度是指一个启动子能 原核基因启动子 够多大程度地结合RNA 聚合酶并 引发转录过程。 RNA 聚合酶 -35 -10 • 原核基因的启动子主要包括-35和- 10 区，真核基因启动子则主要是 TATA 盒与一些上游转录活化序列 真核基因启动子 UAS 。这些序列被称作顺式作用 元件 （cis序列）。 RNA 聚合酶 UAS TATA • 一般认为启动子的强度与cis序列 的最佳配置相关，在人工构建强 启动子时主要是尝试把不同基因 的启动子的cis序列进行重组。 启动子 • 根据表达的方式可以把启动子分为两类： – 构成性表达启动子：持续表达 – 诱导性表达启动子：只在诱导条件下表达。 启动子 宿主 构成性表达 诱导表达 大肠杆菌E. coli lac, tac, ara pBAD, λP , L T7 枯草芽孢杆菌 蛋白酶、淀粉酶基因 的启动子 酿酒酵母S. cerevisiae ADH1 ，TDH3 GAL1 ，PHO5 毕赤酵母P. pastoris GAP AOX 诱导性