(完整版)免疫沉淀法原理及操作.docVIP

免疫沉淀法是一种将蛋白质视为抗原，并利用抗体与之进行特异性结合的特性研究蛋 白质间交互作用的生物技术。  这项技术可以从含有不同蛋白质的样品中，  分离和浓缩出特定 蛋白质，即纯化蛋白质，比如沈涛等在研究骨肉瘤细胞中  ArgBP2  的表达和定位中就用到这 项技术来纯化  ArgBP2  蛋白。 其原理是在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结 合于 sepharose beads上的 proteinA/G ，与细胞中有目的蛋白结合，就形成一种免疫复合物，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。 免疫沉淀的操作过程主要分三个阶段：第一步是制备抗原溶液，任何抗原溶液均可作 为免疫沉淀的材料来源， 一般采用细胞或组织制备的裂解物； 第二阶段是对裂解物进行预处 理，免疫沉淀要求抗原的纯度尽可能高， 用不与待检抗原结合的非特异性抗体预处理， 可以 从抗原溶液中除去非特异性结合蛋白； 最后阶段是免疫复合物的形成与纯化， 即在预处理过 后的裂解物中加入特异性抗体形成免疫复合物，然后将免疫复合物经蛋白 A 或蛋白 G 结合 的琼脂糖或聚丙烯酰胺微珠等固相基质进行纯化。 蛋白 A 和蛋白 G 对抗体的 Fc 段有较高的 亲和力。蛋白 A/G 与抗体结合后，通过洗涤微珠即可除去未结合的蛋白，剩下与基质结合 的即是纯化