CTLA-4胞外段与HBsAg融合DNA疫苗增强抗HBV免疫的研究.docxVIP

CTLA-4 胞外段与 HBsAg融合 DNA疫苗增强抗 HBV免疫的研究 乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus,HBV) 感染是世界性的公共卫生问题 ,HBV 感染所致的慢性肝炎及其并发症严重危害了人类健康。 目前临床上对慢性肝炎的 治疗主要是采用 α干扰素和核苷类药物进行抗病毒治疗 , 但它们清除 HBVcccDNA 的作用有限 , 因此急需新的治疗策略。 HBV感染慢性化与机体抗 HBV特异性免疫应答的缺陷或低下有关 , 有效打破 慢性 HBV感染的免疫耐受状态 , 诱导出多克隆、多特异性、应答强的免疫应答是 慢性肝炎治疗的关键之一。 DNA疫苗能同时诱导机体体液和细胞免疫反应 , 因此 作为治疗性疫苗在慢性肝炎的动物和临床试验研究中显示出良好的应用前景 , 但 其诱导的免疫应答在大动物种系和人类中仍较弱 , 这主要是由于被注射入体内的 DNA只有很少部分被抗原递呈细胞 (antigen-presenting cells,APC) 摄取 , 因此 如何增强 DNA疫苗的免疫原性 , 是目前急需解决的课题。 DNA疫苗编码的抗原靶向引导至 APC表面 , 可促进 APC对抗原的摄取、加工和递呈 , 广泛增强抗原特异性 CD4~+Th应答、CD8~+Tc应答及抗体反应 , 从而放大了免疫应答效应 , 是增强 DNA疫苗免疫原性的有效策略之一。表达于激活 T 细 胞表面的共刺激分子受体—细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4,CTLA-4) 能特异性地结合 APC表面的 B7-1/B7 —2 分子 , 并且它与 B7的亲和力比 CD28与 B7的亲和力高 20～ 50 倍左右。 利用 CTLA-4胞外段与 B7 分子结合的高亲和力 , 能够将与其融合表达的特异 性抗原靶向至 APC,促进 APC对抗原的摄取、 加工和递呈并激活 APC这一特点 , 本 课题构建 CTLA-4胞外段与乙肝病毒表面抗原 (Hepatitis B virussurface antigen,HBsAg) 融合的真核表达重组质粒作为抗 HBV免疫的 DNA疫苗 , 通过免疫 正常 BALB/c小鼠和 HBV转基因小鼠 , 研究该融合表达质粒增强特异性抗 HBV免疫 功能 , 打破 HBV免疫耐受的可能性 ; 同时 , 初步研究该融合表达质粒增强机体免疫 应答的作用机制 , 探讨它作为一种新型乙肝基因疫苗对 HBV持续感染的治疗作用 和应用前景 , 为该疫苗用于慢性乙型肝炎的防治提供实验和理论依据。本研究分 以下四部分。 第一部分 CTLA-4胞外段与 HBsAg融合表达重组质粒的构建及鉴定目的 : 构建 CTLA-4胞外段与 HBsAg融合表达重组质粒 , 并在体外对其进行鉴定 , 以用于后续 DNA免疫的动物实验研究。方法 : 通过 RT-PCR和 PCR法分别获得小鼠的 CTLA-4 胞外段和 HBsAg基因 , 采用分子克隆基本技术将获得的目的基因分别插入至分泌 型质粒 pSecTagB中, 获得重组质粒 pCTLA和 pS,再以 pCTLA为骨架 , 采用分子克 隆法将 HBsAg基因插入 pCTLA中的 CTLA-4 基因的 3’端, 从而得到融合表达质粒 pCTLA-S。 全自动序列分析仪验证序列正确后 , 用脂质体转染法 , 将上述重组质粒转染 至真核细胞 Cos-7, 分别用 RT-PCR和放免法检测目的基因 mRNA和 HBsAg的表达。 结果 : 测序分析结果显示 , 重组质粒 pCTLA、pS 和 pCTLA-S中插入了正确的基因序 列。 RT-PCR法检测 pCTLA、pS 和 pCTLA-S转染的 Cos-7 细胞中均有特异性目的 基因 mRNA的表达 , 放免法检测表明 pS 和 pCTLA-S转染 Cos-7 的胞内和胞外均有 HBsAg的表达。结论 : 成功构建了 CTLA-4胞外段与 HBsAg融合表达重组质粒 pCTLA-S及对照重组质粒 pCTLA和 pS, 并能在真核细胞内有效表达。 第二部分 CTLA-4 胞外段与 HBsAg融合表达重组质粒免疫增强小鼠抗 HBsAg 免疫应答的研究目的 : 研究 CTLA-4胞外段与 HBsAg融合表达重组质粒免疫增强小 鼠抗 HBsAg免疫应答的特点 , 探讨该融合重组质粒免疫用于抗 HBV感染的治疗的 可行性。方法 : 将重组质粒 pCTLA-S及对照重组质粒 pCTLA、pS 和 pSecTagB经超 纯质粒大量抽提后 , 常规肌肉免疫 BALB/c 小鼠后 , 采用 ELISA 法动态检测小鼠血 清抗 -HBs; 在加强免疫 4 周后处死一半小鼠 (4