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DR3胞内信号通路活化的结构基础 肿瘤坏死因子受体超级家族 (TNFRSF)是免疫系统中最重要的家族之一 , 它们 广泛调控各种免疫反应如免疫器官的发育、 共刺激淋巴细胞、 决定淋巴细胞的命 运等。在 TNFRSF家族中的成员中 ,DR3是与 TNFR1氨基酸序列相似度最高的受体。 分子结构上 , 两个受体均含有胞外区四个重复的半胱氨酸富有结构域 (cysteine-rich domain, 简称 CRD)和胞内区的死亡结构域 (death domain, 简称 DD)。 DR3的主要功能包括参与促炎性免疫反应和细胞的存活。 当配体 TL1A(TNF-likeligand1A, 简称 TNFSF15)激活信号通路时 , 胞内区的 DR3可以招募其下游适配体分子 TRADD(TNFR-associateddeath domain), 最终可 以激活 NF-κB 信号。目前对 DR3受体信号传递过程中的构象变化没有深入研究 , 因此本论文选其为主要研究对象。 死亡结构域作为死亡结构域超级家族 (death domain super family,DDS) 的 一员 , 是由六个两性的 (amphipathic) α - 螺旋组成的反平行的希腊回纹花样。 DR3 的死亡结构域 ( 简称 DR3 DD)由约 80 个氨基酸组成 , 它可以通过同型相互作用 (homotypic interaction) 与自身或者与 TRADD相互作用。 作为一个重要的接头蛋白 ,TRADD由折叠成 α- β三明治结构的 N端结构域和 C端的 DD结构域组成。目前 ,TRADD 的 N 端结构域与 TRAF2(TNF receptor-associated factor 2) 的 TRAF结构域的复合物晶体结构己成功解析 , 然而上游的 DR3如何招募 TRADD仍有待研究。 本论文有以下三个主要结果 :(1) 我们成功解析了鼠源和人源的 DR3DD晶体 结构并获得两个完全不同的折叠花样。鼠源的 DR3DD结构属于经典的 DD结构 , 即由六个 α- 螺旋组成的较为松散的希腊回纹花样 ; 而人源 DR3DD结构为非经典 DD结构 , 它由五个 α- 螺旋组成 , 其中第三和第四个 α - 螺旋成为一个较长的螺旋。 同时疏水界面的暴露使得人源 DR3 DD在晶体中具有疏水相互作用界面。通 过酵母双杂交、哺乳动物双杂交、 NF-κB luciferase assay 、小角散射等方法证明鼠源和人源的溶液构象和细胞内功能一致 , 因此提出假设 : 两个不同的晶体结构代表这 DR3DD的两种不同构象。 (2)DR3 DD 间的同型相互作用对信号传递至关重要。我们通过酵母双杂交、 哺乳动物双杂交、 NF-κB luciferase assay 、小角散射、 pull-down assay 等 方法初步鉴定 DR3中 DR3 DD-DR3 DD、DR3 DD-TRADD相互作用的关键位点 , 并证 DR3招募 TRADD依赖于“开放式”构象。 通过酵母双杂交、哺乳动物双杂交、 pull-down assay 等方法 , 确定了 TRADD与 DR3DD结合区域在高度保守的第 199-213 位氨基酸区域 , 根据 C端 TRADD NMR结构 , 这一区域位于 β 发卡花样上。综上 , 本论文中我们提出以下假设 : 静 息状态下的 DR3 DD呈“闭合式”构象 ; 当被胞外信号激活时 , 通过构象变化形成较舒展的“开放式”构象 , 从而招募下游适配体分子 TRADD,而 TRADD则通过其 β 发卡花样结合至 DR3 DD。