基于重组酶聚合酶扩增技术快速检测鲍曼不动杆菌及碳青霉烯类耐药基因的研究.docxVIP

基于重组酶聚合酶扩增技术快速检测鲍曼不动杆菌及碳青霉烯 类耐药基因的研究 目的 :1. 建立重组酶聚合酶扩增技术（ Recombinase Polymerase Amplification RPA ） 15ul 反应体系（本文中简称 RPA-15ul 反应体系）快速检 测鲍曼不动杆菌的实时荧光检测方法 , 并同时进一步检测临床分离株 , 以评估该 方法的临床实用性。 2. 选择鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类耐药基因中检出率最高的 blasubOXA-23/sub基因作为检测目的基因 , 建立实时荧光重组酶聚合酶扩增 技术 15ul 反应体系快速检测耐药基因的方法 , 以期检测细菌的同时完成耐药基 因的测定 , 指导临床快速选择敏感抗生素。 方法 :1. 分别根据鲍曼不动杆菌的鉴定基因 blasubOXA-51/sub与 16s-23s rRNA ITS 基因的特异保守序列按照 TwsitDX Inc 公司提供的 RPA引物 与探针的设计原则设计一系列引物与探针 , 通过引物筛选 , 各选择一套最优的引 物与探针分别进行特异性与灵敏性评价。 以铜绿假单胞菌、 白色念珠菌、 金黄色 葡萄球菌、大肠杆菌四种非鲍曼不动杆菌作为阴性对照菌 , 采用聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction PCR ）、实时荧光定量 PCR（Real-time Quantitative PCR qPCR ）和 RPA-15ul 反应体系作为核酸扩增技术 , 分别验证两种鉴定基因引物与探针的特异性 ; 对菌液进行梯度稀释后提取模板 , 采用上述三种扩增技术分别验证两种鉴定基因的灵敏性 , 并比较三种方法灵敏性的差异以及两种鉴定基因灵敏性的不同 ; 同时进一步采用 PCR及 RPA-15ul 反应体系分别扩增两种鉴定基因检测 30 株鲍曼不动杆菌临床分离株 , 以验证 RPA-15ul 反应体系的实际应用性。 2. 以 30 株鲍曼不动杆菌临床分离株为研究对象 , 采用 K-B 纸片琼脂扩散法 （ Kirby-Bauer 法）检测 30 株临床分离株对 19 种抗生素的敏感情况 ; 根据 TwsitDX Inc 公司提供的 RPA引物与探针的设计原则设计鲍曼不动杆菌碳青霉烯 类耐药基因 blasubOXA-23/sub基因的引物与探针 , 通过 PCR和 RPA-15ul 反 应体系扩增 30 株鲍曼不动杆菌临床分离株的目标 DNA,评估两种检测方法的检出 率 , 并结合药物敏感实验 , 分析鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素与耐药基因 bla subOXA-23/sub 基因之间的联系 , 同时评价 RPA-15ul 反应体系检测耐药 基因的可行性。结果 :1. 本研究中 RPA-15ul 反应体系检测鲍曼不动杆菌的鉴定基 blasubOXA-51/sub基因与 16s-23s rRNA ITS 基因的灵敏性相当均为 2.86CFU/ml, 与 PCR、qPCR灵敏性一致 ; 三种检测方法中 , 两种鉴定基因的特异性 均为 100%。 RPA-15ul 反应体系分别扩增两种鉴定基因检测 30 株临床分离株 , 检出率均 100%,与 PCR结果完全相符。 2.K-B 纸片琼脂扩散法检测 30 株鲍曼不动杆菌临床分离株的药物敏感实验结果如下 :8/30 （ 26.7%）株对米诺环素耐药 ,10/30 33.3%）株表现为中介 ,12/30 （40.0%）株表现为敏感 ;17/30 （56.7%）株对头孢哌酮 / 舒巴坦耐药 ,8/30 （26.7%）株表现为中介 ,5/30 （16.6%）株表现为敏感 ;27/30 （97.0%）株对阿米卡星、美洛培南、亚胺培南耐药 ,3/30 （ 10.0%）株表现为敏感 ;28/30 （93.3%）株对萘替卡星、庆大霉素、头孢他啶、妥布霉素耐药 , 仅 2/30 （ 6.7%）株表现为敏感 ;29/30 （ 96.7%）株对氨苄西林 / 舒巴坦、环丙 沙星、四环素、头孢吡肟、头孢噻肟、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林 / 他唑 巴坦耐药 , 仅 1/30 （ 3.3%）株表现为敏感 ;30/30 （ 100%）株对复方新诺明耐 药 ;30/30 （100.0%）株临床分离株均表现为对多黏菌素 B 敏感。 RPA-15ul 反应体系扩增鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类耐药基因 blasubOXA-23/sub基因 , 显示 27/30 （90%）株出现扩增信号 , 仅 3/30 （10%） 株为阴性 , 与药物敏感实验结果对比发现未出现扩增的 3 株临床分离株均对美洛 培南、亚胺培南敏感 , 即 27 株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌 （ Carbapenem-resistant Acinetobacter b