转基因克隆关键技术.docVIP

转基因克隆技术研究进展 摘要：转基因克隆技术是最近发展起来利用细胞核移植技术生产转基因动物方法，它是以动物体细胞为受体，将目标基因以DNA转染方法导入能进行传代培养动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。和传统转基因方法相比含有显著优势。本文概述了传统转基因技术缺点、转基因克隆技术优越性、研究概况和现在存在问题等。 关键词：转基因动物 克隆 转基因克隆 引言： 转基因动物( transgenic animal)是指用人工方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞，使外源基因和动物本身基因组整合，并随细胞分裂而增殖，从而将外源基因稳定地遗传给下一代工程化动物。[ 1 ] 在转基因动物作为当今生命科学中一个发展最快、最热门领域正在改变着生物医药、农业生产、环境保护、生物材料，甚至是整个生命科学研究和发展面貌时代背景下，怎样高效率低成本生产出所期望转基因动物已成为科学界甚至商界关注热点。 克隆(cloning)是英语“clone”音译，起源于希腊语“klon”[2]，原意是扦插枝条，即无性繁殖。动物克隆指不经过精子和卵子受精过程而取得和亲本含有相同遗传物质后代过程。因为细胞核移植是产生克隆动物有效方法，所以在通常情况下大家往往把它称为动物克隆技术。克隆技术发展为转基因动物研究应用带来了契机， 二者结合现有迫切性又有肯定性。而且，这种结合不仅仅是简单技术叠加， 而是技术重组、综合和优化[3]。 转基因克隆动物技术是转基因动物技术和克隆动物技术有机结合，它是以动物体细胞(包含动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等)为受体，将目标基因以DNA转染方法导入能进行传代培养动物体细胞， 再以这些体细胞为核供体， 进行动物克隆。[3] 转基因技术和克隆技术结合，创建转基因克隆动物， 已经成为本世纪培育遗传工程动物主导性技术路径。转基因克隆技术作为一个高效而低成本生产转基因动物技术已经为转基因动物生产带来了新契机。本文概述了传统转基因技术缺点、转基因克隆技术优越性、研究概况和现在存在问题等。 1.动物传统转基因技术概述 现代转基因动物研究始于20 世纪80年代初。1980年， Gordon等首次报道用显微注射法取得转基因小鼠。1982年， Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵雄性原核中，取得了个体比对照鼠增大一倍“超级小鼠”，以后揭开了转基因动物研究新篇章[1，4]。前后出现了显微注射法、反转录病毒载体法、胚胎干细胞介导法、精子载体法等转基因动物生产技术。不过因为这多个方法全部各自存在部分缺点，所以在技术上制约了转基因技术应用于转基因动物生产发展速度，现分述以下。显微注射法存在转基因整合是随机，所以整合位点、拷贝等均难以正确控制。同时随机整合也可造成较严重插入突变，影响受体动物基因组其它结构和功效，无法满足正确修饰要求。反转录病毒载体法只能经过嵌合体路径获取纯系转基因动物，试验周期长;目标基因不能超出100kb;因为含有病毒DNA，可能会出现病毒本身复制和表示现象，安全性令人担忧。胚胎干细胞介导法适用物种少[ 5， 6]，只能适适用于已建立了真正ES细胞系小鼠。另外动物育种需经过嵌合体路径，受ES细胞生殖嵌合能力和交配机率影响，试验周期较长。精子载体法和受精卵显微注射路径一样含有目标基因整合随机性和无法早期验证修饰事件等不足之处。 上述多个转基因技术中常见方法不足确实在技术上制约了转基因技术在各个方面应用范围，总来说转基因技术存在以下问题： (1) 整合和表示效率低 用显微注射法一次可向一个卵中注射几百个转基因拷贝，但总是单位点整合或单位点多拷贝整合，Hochic 等[7]研究了显微注射法转基因动物总效率为0.38%，田小利等[8]对大鼠统计结果阳性率为3.3%，总效率为1%。说明转基因动物总效率很低。转基因整合还可造成宿主细胞基因突变，造成四肢畸形、死胎、木乃伊等现象发生。 (2) 转基因遗传率低 很多研究表明，转基因动物及其后代并不能够确保外源基因世代传输，外源基因整合后轻易从基因组型中消失，并不能在任何情况下连续传代。只有单位点整合才能以孟德尔方法遗传[9]。 (3) 生产成本高 因为基因整合和表示效率较低，生产一头有用转基因动物，需用大量供体和受体动物，包含很高研究费用，转基因动物产业化受到很大限制。据Wall等[10]计算，生产一头祖代转基因猪需花费2.5万美元，生产一头转基因牛需要50万美元。假如用体外成熟和体外授精方法，成本约可降低1/3。 2.转基因克隆技术生产转基因动物优越性 转基因克隆技术用于生产转基因动物可行性和优越性在于它直接以胎儿体细胞为转基因受体细胞，继而以转基因体细胞为核供体制作转基因克隆动物。其采取简便体细胞转染技术实施目标基因转移，能够避免家畜生殖细胞起源困难和低效率。同时，采取转基因体细胞