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各种酶活性测定方法 第一 超氧化物歧化酶 SOD测定一、原理 超氧 物 歧 化酶 （ superoxidedismutase ，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（ NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲 腙，后者在 560nm 处有最大吸收。 而 SOD 可清除 O2，从而抑制了甲腙的形成。 于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片 （二）仪器设备： 1.高速台式离心机； 2. 分光光度计； 3.微量进样器； 4.荧光灯（反应试管处照度为 4000Lx）；5.试管或指形管 数支。 （三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（）； 130mmol/L 甲硫氨酸（ Met ）溶液：称用磷酸缓冲液定容至 100ml；μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取用磷酸缓冲液定容至 100ml，避光保存； 4. 100 μ mol/L EDTA－ Na2 溶液：称取－ Na2 用磷酸缓冲液定容至1000ml； 5. 20μ mol/L 核黄素溶液：称取 0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至 1000ml 避光保存。 三、实验步骤 酶液提取 取一定部位的植物叶片 （视需要定，去叶脉） 0.5g 于预冷的研钵中， 1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成 浆，加缓冲液使终体积为 5ml 。取～ 2ml 于 1000rpm 下离心 20min ，上清液即为 SOD粗提液。 2. 显色反应 取 5ml 指形管（要求透明度好） 4 支， 2 支为测定管，另 2 支为对照 管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量 （ml）终浓度（比色时） L 磷酸缓冲液 L Met 溶液 L 750 μ mol/L NBT 溶液 μ mol/L 100 μ mol/L EDTA－Na2 液 μ mol/L 20 μ mol/L 核黄素 μmol/L 酶液支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水总体积混匀后将 1 支对照管置暗处，其它各管于 4000Lx 日光下反应 20min （要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长） 。 SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。 四、结果计算 已知 SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原的 50％为一个酶活性单位表示， 按下式计 算 SOD 活 性 。 SOD 总 活 性 ＝ (Ack － 上式中， SOD比活力＝ SOD总活性蛋白质含量式中 SOD 总活性以每克鲜重酶单位 表示；比活力单位以酶单位／ mg 蛋白表照光对照管的吸光度 AE 样品管的示 Ack 吸光度 V 样品液总体积 （ ml）Vt 测定时样品用量（ ml ） W 样鲜重（ g）蛋白质含量 单位为： mg 蛋白／ g 鲜重。 SOD、POD、CAT、MDA 的测定方法 -非试剂盒法 缩写： SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛； PVP：聚乙烯吡咯烷铜 K-30；L-Met：甲硫氨酸； NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸； TCA： 三氯乙酸； PBS: 磷酸缓冲液 SOD的测定方法 加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液： L-Met: NBT: EDTA-Na2: 核黄素： 酶液： 蒸馏水： 试剂配制： L PBS： 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met 用 PBS 定容至 100ml 750mmol/L NBT: 0.06133g 用 PBS定容至 100ml(避光保存 ) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g 用 PBS 定容至 1000ml 20umol/L 核黄素 : 0.0753g 用蒸馏水定容至 1000ml(避光保存 ) 注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定 A560 值 的测定方法 试剂配制： （1）5% TCA： 5g 用蒸馏水定容至 500ml 2）% TBA：2.5g 用 TCA定容至 500ml 方法： 酶液 1ml—%TBA和 5%TCA—混合后在 100 度水浴煮沸 15min —迅速冷却， 10000r/min 离心 10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在 532nm、600nm 处的吸收 值 的测定方法 试剂配制 ： 1）L 的醋酸缓冲液： +得到的醋酸缓冲 液 AL 的 HAc 溶液 )—6ml 冰醋酸溶到 494ml 蒸馏水中 BL 的