基于转录组分析和基因编辑技术对高表达植酸酶毕赤酵母MAPK信号通路作用的初步研究.pdfVIP

摘要 摘要 巴斯德毕赤酵母 （Komagataella phaffii syn. Pichia pastoris ）作为目前重要的 外源蛋白表达宿主菌之一，已经在工业生产当中得到广泛应用。在分子生物学研 究中，对于基因功能的探索是揭示生命奥秘的关键，如何能够有效的探究基因的 功能显得极其重要。目前，对于该菌株发酵过程中相关基因的表达与菌株代谢规 律了解甚少，特别是有关信号传导通路对蛋白质诱导表达过程中的作用。正因为 缺乏对细胞信号转导通路的认知，发酵过程缺乏有效的调节与控制，外源蛋白的 表达量也有待进一步的提高。 基于此现状，本文首先利用实验室构建的高表达植酸酶的毕赤酵母基因工 程菌株 K. phaffii GS115/pPIC9K-PhyA 为出发菌株，在 10,000 L 发酵罐进行了发 酵研究，利用 RNA-Seq 技术分别对菌株在批量发酵阶段、甘油流加阶段、甘油 - 甲醇混合进料阶段以及在甲醇诱导阶段的不同时期进行基因表达的研究：结果 表明显著上调的基因数主要发生在促分裂原激活的蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases ，MAPK ）信号通路、过氧化物酶体、甲醇代谢、淀粉和蔗糖代谢、 自噬、线粒体吞噬和减数分裂的代谢过程中。其中MAPK 信号通路中基因数量 的上调最为显著。揭示 MAPK 信号通路可能与毕赤酵母细胞的生长有关，并通 过磷酸化和去磷酸化将甲醇刺激传递至调控因子来调节 AOX 1 启动子（PAOX 1 ）， 从而影响该启动子下外源蛋白的表达。 其次，为了解决 K. phaffii 基因工程一直缺乏简单、有效的基因敲除工具的 问题，我们尝试在毕赤酵母中构建了 CRISPR/Cas9 基因编辑系统。首先成功在 毕赤酵母中构建了利用 PAOX 1 高效表达且遗传稳定的mCherry 荧光系统 。构建了 由 GAP 启动子（PGAP ）表达 spCas9 和在 PScSNR52 驱动下表达 sgRNA 的 pGAP- spCas9-sgRNA 基因编辑系统，然而该系统的编辑效率极低，仅获得一个转化子， 并不是能够对毕赤酵母进行靶向基因修饰的最佳工具。随后，构建了由毕赤酵母 内源性组成型双向启动子 PHTX 不同方向，同时表达经过人源密码子优化 hsCas9 以及携带 了HH 和 HDV 核糖酶识别位点 的 sgRNA 的CRISPR/Cas9 系统 pHTX- I 摘要 hsCas9-sgRNA-Z 。针对 mCherry 荧光系统设计的3 个靶位点均获得了 60 % 以上 的编辑效率，证 明该系统能对毕赤酵母实行有效的编辑，是以后对毕赤酵母基因 组进行精准操作的较好选择 。 基于转录组分析，利用本实验构建的 CRISPR/Cas9 系统对 PAS_chr1-1_0273、 PAS_chr1-3_0061、PAS_chr1-1_0201、PAS_FragB_0046 和 PAS_chr3_0895 5 个基 因甲醇诱导阶段MAPK 信号通路显著上调的基因进行敲除，主要获得以下实验 结果： （1）PAS_chr1-3_0061 之外，其余 4 个靶序列突变均由 CRISPR/Cas9 靶基 因编辑系统成功介入 。 （2 ）测 定 了 PAS_chr1-1_0273 、PAS_chr1-1_0201 、PAS_FragB_0046 和 PAS_chr3_0895 基因缺失菌株在葡萄糖、甘油及甲醇为碳源的培养基中的生长特 性 。结果显示， PAS_FragB_0046 缺失后会促进菌株在甲醇中的生长，其余的3 个基因的敲除均会对菌株在甲醇中的生长造成不利影响，其中PAS_chr1-1_0201 和 PAS_chr3_0895 基因的缺失对细胞整个生长均造成 了显著影响（p 0.05 ）。 （3 ）与野生株相比，在甲醇诱导条件下这几个敲除菌株中均有不同程度 的 植酸酶表达，然而植酸酶的活性较野生型相比均有明显的降低。PAS_FragB_0046 基因缺失后 PA OX1 活性最低，植酸酶活性仅为 4.95 U/mL ，相比于野生型下降了 98.46%，其次，P