犬瘟热病毒流行毒株序列分析及纳米抗体噬菌体库的构建与筛选.pdfVIP

摘 要 犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV) 引起的一种急性且高度传染性的传染病。CD 的发生率很 高，致死率高达50 ％，严重影响了犬类繁殖和毛皮动物繁殖的发展。因此，本研究收集济南地区 疑似感染CD 的临床样本，扩增CDV H 基因并进行遗传差异分析。同时，用CDV 免疫羊驼，构 建犬瘟热病毒特异性纳米抗体噬菌体文库，并进行犬瘟热的纳米抗体的筛选和表达。 实验1：济南犬瘟热病毒H 基因的克隆及遗传进化分析 为了调查济南宠物犬瘟热的感染状况，于2019 年1 月至2019 年6 月在济南一家宠物医院随 机收集了56 例怀疑感染CDV 的临床拭子样本，通过RT-PCR 方法扩增了CDV H 基因的全长序 列，经测序后分析了H 基因序列的遗传变异。结果显示，RT-PCR 共检测到7 个阳性样品。 H 基 因核苷酸同源性为98.7 ％-99.9 ％，氨基酸同源性为98.7 ％-100 ％。与疫苗株相比，差异很大。与 疫苗株相比，同源性为90.0 ％-90.9 ％，氨基酸同源性为88.8％-91.4 ％。遗传进化表明，这7 个菌 株均为中国目前所有的亚洲Ⅰ型菌株，与北京毒株(BJ17BC1)及黑龙江毒株(HRB-E8 和 HLJ-1-14) 相似。与广东株(GD1811 和GD1810)形成一个大的分散分支。H 基因的氨基酸基因分析表明，与 参考菌株相比，7 个毒株变异程度不同。糖基化位点分析显示，除了SD-07 包含8 个潜在的天冬 酰胺糖基化位点外，其余6 个菌株均为9 个潜在的天冬酰胺糖基化位点，而这6 个菌株均包含野 生株。唯一的g3(309)糖基化位点与疫苗株有很大差异，但与亚洲Ⅰ野生株高度一致。H 基因抗原 的预测分析显示7 种野生病毒株与疫苗株有显着差异。研究表明，济南流行的CDV 主要是亚洲Ⅰ 型。这7 个野毒株与疫苗株有很大的遗传差异，并且不同株之间存在遗传多样性。 实验2 ：CDV 特异性抗体的噬菌体文库的构建和鉴定 为了获得CDV 特异性抗体噬菌体文库，首先使用超纯化的CDV ，然后使用纯化的CDV 免 疫羊驼，使用巢式PCR 扩增纳米抗体(Nanobodies ，Nbs)序列，构建CDV 特异性抗体噬菌体文库， 然后选择40 个单克隆，计算阳性克隆的数量，随机选择13 个序列进行序列验证，并计算存储容 量并分析文库多样性。结果表明，第四次免疫后，血清抗体滴度可达1：25,000 ，符合文库建设的 要求。巢式PCR 扩增了一个400 bp 的条带，与预期的Nbs 大小一致。噬菌体展示文库的文库容 量确定为3.41×109 PFU ，阳性率为90 ％。测序结果表明，选择的13 个VHH 片段的序列不同， 其中互补性决定了3 区(CDR3)的最佳多样性。以上结果表明该研究成功构建了CDV 特异性抗体 噬菌体文库。该文库容量大，多样性丰富，阳性率高，为后续的纳米抗体表达奠定了基础。 实验3：犬瘟热特异性纳米抗体的筛选和表达 将纯化的CDV 包被在ELISA 板上，并对CDV 特异性抗体噬菌体文库进行三轮淘选以富集 特异性结合CDV 的噬菌体。选择单克隆，并使用噬菌体-ELISA 鉴定和选择具有高结合能力的噬 菌体。通过巴斯德毕赤酵母表达系统表达和纯化该基因序列，并通过ELISA 和 IFA 鉴定其结合 力。结果表明，经过三轮淘选，总共富集了85 个阳性克隆，阳性率为88.5％(85/96) ；酵母表达系 统用于表达两个纳米抗体。WB 鉴定结果表明，在 15 kDa 处有明显的条带。ELISA 和IFA 鉴定 实验中表达的两种纳米抗体均可特异性结合 CDV 。上述结果表明该研究成功地筛选并表达了两 种与CDV 特异性结合的纳米抗体菌株。 I 综上，本研究初步分析了济南地区当前CDV 流行株的遗传差异，对有针对性的有效CD 防 治措施具有指导意义。成功构建了CDV 特异性抗体噬菌体文库，表达纯化了2 株特异性结合CDV 的纳米抗体，为后期建立犬瘟热诊断方法和筛选具有中和活性的纳米抗体提供了实验基础。 关键词：犬瘟热病毒，抗体噬菌体文库，纳米抗体，毕赤酵母表达系统 II Abstract Canin