嵌合南非2型口蹄疫病毒抗原表位PPV VLPs载体疫苗的构建.pdfVIP

摘 要 口蹄疫病毒 （Foot and Mouth Disease Virus，FMDV ）分为7 个血清型：A 、O 、C 、Asia l、 SAT1、2 、3 。其中，南非型 （Southern Africa Territories ，SAT ）口蹄疫具有明显的地域性，主要 集中在撒哈拉沙漠以南，侵害水牛及其他偶蹄动物。近几年的报告表明，中东地区暴发了南非2 型口蹄疫 （SAT2 FMD ），跨越了长久以来的地域界限，存在进入我国的风险，给我国的养殖业 造成了潜在的威胁。我国在SAT2 FMDV 方面的研究较少，了解其蛋白结构与抗原表位对研制储 备疫苗具有重要意义。本研究参考相关文献，选择了SAT2 FMDV （PAT/ 1/20 12 ，GenBank ：JX0 14256 ）结构蛋白VP 1 上编码的B 细胞表位 （VYTKAAAAIRGDRAALAAKYADTNHTLPPTFNF GYVTVDK ）和T 细胞表位 （NVQEGRRKHTDVAFLLDRST ），为设计SAT2 FMDV 表位疫苗 奠定了基础。 猪细小病毒 （Porcine Parvovirus，PPV ）能导致初产母猪及血清学阴性的经产母猪发生流产、 不孕、产死胎、木乃伊胎及弱仔等。在猪群里的检出率高达85% ，对我国养猪业造成巨大的损失。 VP2 蛋白占PPV 衣壳的80% 以上，能够独立形成病毒颗粒。VP2 表面有4 个Loop 环，可以携带 外源表位组装成嵌合型病毒样颗粒 （Virus-like Particles ，VLPs ），诱导机体同时产生针对PPV 和 嵌入表位的特异性抗体和相关细胞因子。本研究欲将选择的SAT2 FMDV 抗原表位嵌入在PPV VP2 蛋白不同位点，组装成不同形式嵌合型VLPs ，并期望其免疫动物后能达到双重效果。 本研究首先使用Bac-to-Bac 系统构建含有PPV AV30 毒株优化后的VP2 蛋白编码基因的重组 杆状病毒，感染sf9 和HF 细胞后表达了VP2 蛋白，分子质量约为64 KDa 。透射电镜（Transmission Electron Micrograph ，TEM ）观察，VP2 蛋白组装成VLPs （命名为VP2-VLPs ），与纯化的PPV AV30 病毒颗粒大小形状相似。将其免疫BALB/c 小鼠，能刺激小鼠产生抗PPV 的特异性抗体。小鼠脾 脏淋巴细胞在PPV AV30 刺激后，出现了显著增殖。血清中检测到了细胞因子：IL-2 、IL-4 和IFN-γ 。 进而利用生物信息学模拟嵌入表位对VP2 蛋白结构的影响，最终确定了VP2 蛋白上3 个位点：N 端和Loop2 区内以及Loop4 区后，设计的嵌合蛋白分别命名为：L B 、NT L B 、NT L B B 、 2 1 2 1 2 4 N(T ) L B B 。将嵌合蛋白编码基因构建到载体pFastBacTMDual 上，Western Blot 及IFA 实验分析 1 2 2 4 表明，重组嵌合蛋白在HF 细胞中表达，嵌入表位能被特异性抗体识别。TEM 显示四种重组嵌合 蛋白都能自我组装成VLPs ，与VP2-VLPs 大小形状相似。本研究成功制备了含有SAT2 FMDV 抗原表位的嵌合型VP2-VLPs ，这将为研制SAT2 FMD 储备疫苗奠定了基础，并期望达到同时预 防PPV 和SAT2 FMDV 的目的。 关键词：SAT2 FMDV ，PPV VP2 ，VLPs ，抗原表位，疫苗 I Abstract Foot and Mouth Disease Virus (FMDV) is divided into 7 serotypes: A, O, C, Asia l, South African Territories (SAT) 1, 2, 3. Among them, SAT FMDVs have obvious regional characteristics, mainly prevailing in the