鼠伤寒沙门氏菌CVCC541耐药性双组分系统的筛选及功能研究.pdfVIP

摘 要 鼠伤寒沙门氏菌 （Salmonella Typhimurium）是革兰氏阴性肠道杆菌，其引起的沙门氏菌病对 人类健康及畜牧业、水产业的健康发展造成严重影响。近年来由于抗生素的滥用，造成的多药耐 药现象极为严重，使沙门氏菌病的防治更加困难。细菌为了生存需要调控自身代谢来适应各种刺 激，最主要的调控系统是双组分系统，该系统与细菌的多种生物学功能相关，是一种磷酸转移信 号转导途径。已报道的沙门氏菌双组分系统有二十多种，本试验研究了ArcA/ArcB、KdbD/KdpE、 RssA/RssB、BaeS/BaeR、PmrA/PmrB、PhoP/PhoQ、RstA/RstB、UvrY、NtrB、TtrS/TtrR、QseB/QseC、 NarL/NarX、DcuS/DcuR、CreC/CreB、GlrR/GlrK、BarA/SirA 和TorR 系统，通过构建上述系统 基因缺失株筛选调控鼠伤寒沙门氏菌CVCC541耐药性的双组分系统，以阐明各系统对沙门氏菌 耐药性调控机制。 本研究利用Red同源重组技术构建了鼠伤寒沙门氏菌CVCC541上述双组分系统基因缺失株， 测定缺失株对抗生素的最小抑菌浓度 （MIC）。结果显示，经PCR 鉴定和测序证实成功构建了鼠 伤寒沙门氏菌CVCC541上述双组分系统基因缺失株。MIC 试验结果表明，与亲本株相比，pmrA、 pmrB 基因缺失后对多粘菌素B 的敏感性分别增加了8倍、16 倍；phoP、phoQ基因缺失后对多 粘菌素B 的敏感性增加了8倍，对强力霉素的敏感性增加了4 倍，phoQ缺失对青霉素G 的敏感 性增加了4 倍；arcA、arcB 基因缺失后对链霉素的耐药性分别增加了16倍和8倍，arcA 缺失对 新霉素耐药性增加了8倍，arcB 缺失对阿米卡星的耐药性增加了8倍；creC基因缺失后对四环素 的耐药性增加了8倍。通过上述试验结果可知调控耐药性的双组分系统有：PmrAB、PhoPQ、ArcAB 及CreCB 系统，其中PmrAB、PhoPQ 系统调控对多粘菌素类的耐药性，ArcAB 系统调控对氨基 糖苷类的耐药性，CreCB 系统调控对四环素类的耐药性。 目前关于ArcAB 系统耐药性研究极少，且调控机制尚不清楚，对该系统arcA、arcB 基因结 56 292 576 717 构的解析表明，arcA 基因的Asp 位点及arcB 基因His 、Asp 、His 位点是其磷酸化信号转 导 的关键 位 点 。本 试验 通 过 pSTV28 质 粒 构 建 了 回复株 CVCC541∆arcA/parcA 、 CVCC541∆arcB/parcB，并通过无缝克隆和重组技术构建点突变回复株arcAAsp-56-Ala、arcBHis-292-Ala、 arcBAsp-576-Ala、arcBHis-717-Ala。PCR 鉴定和测序结果证实成功构建了回复株及点突变回复株。生物 学特性研究结果显示：与亲本株相比，缺失株、点突变回复株生长速率降低，同时回复株生长速 率与亲本株一致，表明该基因缺失后对 CVCC541 的生长有一定的影响；MIC 结果显示 CVCC541∆arcA、CVCC541∆arcB 对氨基糖苷类药物敏感性有不同程度的降低；回复株均表现出 与亲本株相似的药物敏感性；arcA、arcB 基因关键位点突变后与arcA、arcB 基因缺失对鼠伤寒 沙门氏菌CVCC541氨基糖苷类药物耐药性的调控一致。研究表明，arcA、arcB 基因确实通过磷 酸化途径参与鼠伤寒沙门氏菌对氨基糖苷类抗生素的耐药调控。 关键词 鼠伤寒沙门氏菌，双组分系统，arcA 基因，arcB 基因，耐药性 ： III Abstract Salmonella Typhimurium, a Gram-negative intestinal bacillus, is the pathogen of the disease of salmonellosis which has a huge impact on human health, animal husbandry and aquaculture. In recent years, the abuse of