水稻斑点叶突变体M754的基因克隆.pdfVIP

摘 要 斑点叶突变体广义上属于叶色突变体，是研究叶绿素代谢的理想材料之一。本研究实验材料 为一个水稻斑点叶突变体M154 ，由EMS 诱变水稻籼稻品种中鉴100 而来。本研究进行了遗传分 析和基因定位，主要农艺性状观察，生理生化指标测定，互补验证，基因编辑实验，叶绿素降解 代谢过程各种相关酶活性及代谢中间物的含量测定等研究，补充完善了植物叶绿素降解代谢途径。 研究结果如下： 1. 突变体M154 的表型特征为：播种后约14 天，该突变体的底部叶片开始出现红褐色斑点，播 种后约50 天，从低位叶到高位叶叶片基部陆续出现红褐色斑点，并逐渐扩散至整片叶。随后， 斑点叶表型逐渐严重，在分蘖后期甚至有许多叶片完全枯萎。在大田条件下，M154 的主要 农艺性状显著下降，特别是第三节间长度的缩短导致植株变矮；突变体和野生型的总叶绿素 含量在苗期没有显著差异，分蘖期，突变体的总叶绿素含量明显下降，且光合参数显著下降， 表明其光合作用能力明显下降，进而导致其主要农艺性状较差。 2. 突变体M154 叶片中存在大量的细胞死亡：台盼蓝染色显示突变体叶片斑点附近存在大量细 胞死亡，丙二醛（MDA ）大量积累致使细胞膜发生不可逆损伤，TUNEL 实验显示DNA 严重 片段化，可溶性蛋白（SP）含量下降。 3. 突变体M154 中ROS 积累、ROS 清除系统紊乱：各个ROS 清除酶的活性有明显改变，包括 过氧化物酶（POD ）和超氧化物歧化酶（SOD）活性明显高于野生型，而过氧化氢酶（CAT ） 的活性则明显下降，导致突变体叶片的斑点附近有大量O -沉积，但并无H O 明显沉积。 2 2 2 4. 突变体M154 斑点的产生受到光照和机械损伤诱导，突变体在黑暗下保持正常绿色。 5. M154 中PAO 的酶活性降低导致脱镁叶绿酸a （Pheide a ）的积累，是突变体斑点产生的直接 原因，与野生型相比，M154 的PAO 的酶活性、突变基因表达量以及PAO 的含量均有所下降， 而该酶的特异性底物、具有潜在光毒性的Pheide a 含量显著上升。 6. 突变体M154 中叶绿素降解过程的各种相关酶活性和中间代谢产物含量发生明显变化，黑暗 处理后各种相关酶活和中间代谢产物含量也发生明显变化，暗示叶绿素酶（CLHs ）在水稻的 叶绿素降解代谢中可能发挥一定的作用。 7. 突变体的斑点叶表型是由单隐性核基因控制的，该基因编码一个脱镁叶绿酸 a 单加氧酶 （PAO ）。利用简单序列重复（SSR ）标记以及插入缺失（InDel ）标记进行基因定位，最终在 3 号染色体上，标记InDel11 和 InDel16 之间的 145kb 区间内仅检测到一个单碱基突变位点 （SNP ），该SNP 位于OsMH_03G0040800 的第6 外显子中。在编码序列中发生了从A 到T 的单碱基取代，导致从异亮氨酸突变为苯丙氨酸。 8. 突变体M154 的功能互补与基因编辑：通过农杆菌介导的植物转化将野生型植株的PAO 等位 基因转移到M154 突变体背景中以验证候选基因。在分蘖期，当M154 表现出明显的斑点叶 表型时，野生型和互补植物一样没有斑点叶表型，且互补植物的总叶绿素含量已恢复到野生 型植株的水平，表明M154 的功能互补成功；Cas9-2 是CRISPR/Cas9 介导的Kitaake 中PAO 突变的突变植株，它在第4 外显子上有6 个碱基缺失，导致移码突变。与M154 相比，它具 有相似但是更严重的斑点叶表型，表明CRISPR/Cas9 介导Kitaake 的PAO 突变成功。 I 关键词：水稻，斑点叶，脱镁叶绿酸a 单加氧酶，叶绿素降解，叶绿素酶 II