黏附素MAD2在绿僵菌与花生互作中的功能和作用途径.pdfVIP

摘 要 金龟子绿僵菌是防治农林虫害的生物农药中重要的真菌，其腐生、昆虫寄生、植物内生多重 营养方式使之能够适应不同环境和维系种群。近年来绿僵菌的植物内生性引发广泛关注，但诱导 互作的因子并不明确。Metarhizium adhesion like protein 2 （MAD2 ）是绿僵菌与植物作用时的特 异性黏附素，在宿主选择和绿僵菌适应不良环境方面有重要作用。本文以绿僵菌处理的花生根转 录组分析为基础，通过MAD2 蛋白与绿僵菌对比处理，比较花生根中相关受体以及下游途径的响 应，分析MAD2 对花生的诱导反应，为阐释绿僵菌的植物内生性和环境宿存机制提供依据，对指 导绿僵菌综合功能的开发有重要意义。主要结果如下： 1. 金龟子绿僵菌黏附素Mad2 基因克隆、表达与序列分析。克隆了Mad2 的基因，经过测序以 及NCBI 比对，其完整开放阅读框为921bp，编码306 个氨基酸，该蛋白的理论分子量为30.6kDa 。 构建毕赤酵母的真核表达系统，SDS和Western blot 验证说明MAD2 蛋白表达成功， 并且带有可供纯化的His 标签，得到了纯化后的MAD2 蛋白。通过 PredicProteint 预测 MAD2 蛋白疏水氨基酸、蛋白质结合位点等结构域，发现在第290 位氨基酸上存在GPI 结合位点， 且附近24 个暴露的疏水氨基酸说明MAD2 可能结合在细胞膜上。 2. 金龟子绿僵菌与MAD2 处理下花生根受体及相关基因的差异响应。通过RT-qPCR ，验证了绿 僵菌处理4 天后花生根中9 个候选受体的转录水平表达情况，表明免疫相关受体CERK1、FLS2 抗逆有关受体GsSRK 以及共生受体SYMRK 等显示上调表达，与转录组结果一致。在绿僵菌 孢子悬浮液与MAD2 纯化蛋白对比处理12h 后显示，花生根中LysM 受体类激酶LYK3 和G 型凝集素S 受体样激酶GsSRK 均显著上调表达；FLS2 受体在MAD2 蛋白处理后显著上调， 而在绿僵菌处理下相反；BAK1 和CERK1 在两者处理下都下调表达。对防御、抗逆以及共生 相关基因的检测发现，MAD2 蛋白处理使MAPK 途径受抑制，抗逆以及抗病相关的基因下调 表达；而共生相关的离子转运、脂质转移基因上调表达。结果显示MAD2 诱导LYK3 上调表 达并激活了下游共生相关基因和抑制了相关抗性基因，从而促进绿僵菌与花生共生建立。 3. 金龟子绿僵菌与MAD2 处理花生的蛋白表达定量分析。采用TMT 蛋白定量的方法，MAD2 处理花生后得到差异蛋白2550 个，KEGG 富集通路中1326 个上调表达。两者处理下共有113 个差异表达基因富集在酯类代谢途径。筛选后发现，在MAD2 与绿僵菌处理下共有的差异基 因15 个，参与类黄酮与异黄酮合成途径中乔松素、异甘草素、根皮素、黄腐酚、柚皮素、圣 草酚和高圣草酚等类黄酮的合成，并调控异甘草素和根皮素形成刺芒柄花素和李属异黄酮苷 形成。鉴于根系中类黄酮参与诱导根瘤菌结瘤基因和丛枝菌根真菌共生基因的表达，说明 MAD2 有助于绿僵菌诱导花生信息交流物质的形成，通过加快花生的脂质合成与代谢，同时 诱导花生黄酮类物质的形成，参与绿僵菌在花生中的定植和共生建立。 关键词：黏附素MAD2 ，菌-植物相互作用，绿僵菌，LYK3 ，花生 I Abstract Metarhizium anisopliae （M.anisopliae ）is an important entomopathogenic fungus used as a biopesticide in control of agricultural and forestry pests. The fungus evoluted differently trophic modes such as pathotroph, symbiotroph and saprotroph, to adapt to different environments and sustain populatio