耐草甘膦基因aroAA1501的拆分及功能重建.pdfVIP

摘 要 自转基因作物商业化应用以来，耐除草剂一直是转基因作物的主要性状，20 19 年耐除草剂转 基因作物的种植面积占全球转基因作物种植面积的46% 。转基因耐除草剂作物的大面积种植带来 了巨大的经济和社会效益，但草甘膦抗性杂草的出现也引起了人们对其产生的环境风险的广泛关 注。基因拆分技术培育的转基因作物能够很好的避免目标性状逃逸到环境中所带来的影响，是防 控基因飘流和防止耐草甘膦杂草产生的有效措施。为了利用基因拆分技术培育aroAA1501基因耐草 甘膦水稻，本研究通过结构分析法筛选基因的可拆分位点，并通过功能互补试验获得基因的可拆 分位点，通过原核系统分析比较不同位点拆分后，在intein 介导下重新组装蛋白的草甘膦耐受性 及酶动力参数，获得适宜的可拆分位点，研究结果为利用基因拆分技术培育耐草甘膦的转基因水 稻提供技术支撑，同时为利用基因拆分技术防控基因飘流、预防耐草甘膦杂草产生提供技术储备。 具体研究结果如下： 1) 生物信息学分析预测aroAA1501基因编码的EPSPS 蛋白的一级结构、二级结构和三级结构， 根据蛋白结构预测出了13 个可能拆分的位点。利用PCR 的方法将aroAA1501拆分成N 端 （An ） 和C 端 （Ac ）两部分，并通过融合PCR 法分别与SspDnaE intein 的N 端 （In ）和C 端 （Ic ）结 合形成融合基因An-In 和Ic-Ac。 2) 以pETDuet-1 载体为基础载体，构建单独An-In 或Ic-Ac、以及同时An-In 和Ic-Ac 的原核 表达载体，并导入aroA 缺陷型菌株ER2799 进行功能互补试验。发现只有同时含有140N-In 和 Ic-141C、224N-In 和Ic-225C、230N-In 和Ic-231C 以及完整aroAA1501 的ER2799 重组菌株能在含 有20 mM 草甘膦MOPs 限制性培养生长。RT-PCR 结果显示在同时含有140N-In 和Ic-141C、 224N-In 和Ic-225C、230N-In 和Ic-231C 的ER2799 重组菌株中不能扩增到完整的aroAA1501基因。 上述结果表明，aroAA1501基因在 140/ 14 1、224/225 和230/231 位点拆分后，在intein 介导下能重 新组装成完整有功能蛋白，赋予重组ER2799 菌株耐受草甘膦的能力。 3) 将含有不同质粒的ER2799 重组菌株接种到不同草甘膦浓度的MOPS 培养基上，进行草甘 膦耐受性分析。结果发现aroAA1501基因在不同位点拆分后重新组装成的功能蛋白对草甘膦的耐受 性存在差异，其中140/ 14 1 位点拆分后重新组装蛋白能耐受20 mM 的草甘膦，低于完整蛋白的草 甘膦耐受性；224/225 位点拆分后重新组装蛋白与完整蛋白对草甘膦的耐受性基本一致，能耐受 40 mM 的草甘膦，而230/231 位点拆分后重新组装蛋白耐耐受120 mM 的草甘膦，比完整蛋白对 草甘膦的耐受性提高了2 倍。 4) 荧光定量PCR 分析了不同ER2799 重组菌株中外源基因的表达情况。发现融合基因 140N-In、224N-In 和230N-In 的表达量高于完整aroAA1501基因；而融合基因Ic-141C、Ic-225C和 Ic-231C 的表达量低于aroAA1501基因，其中Ic-231C 的表达量最低，说明不同ER2799 重组菌株对 草甘膦的耐受性差异不是由于基因表达差异造成的。 5) ELASA 酶活测定结果表明，在 140/ 14 1 和224/225 处拆分后，其重新组装成的功能蛋白的 酶活与完整蛋白的基本一致；在230/231 处拆分后，其重新组装成的功能蛋白的酶活比完整蛋白 的要高，达到0.05 差异显著水平。 6) 分析了来源于不同ER2799 重组菌株中EPSP 合酶的酶动力相关参数，发现230/231 位点 拆分后重新组装成的EPSPS 的酶活为 17.861±0.267 ，IC50 约为 10880 ，Km 值为56.8，Ki 值为 II 29.4 ；140/ 14 1 位点拆分后重新组装成的EPSPS 酶活为5.33±0.533，IC50 约为2700，Km 值为82.4 ， Ki 值为48.6 ；224/225 位点拆分后重新组装成的EPSPS 酶活为9.27±0.133，IC5