‘魁绿’、‘绿王’等六份软枣猕猴桃资源超低温保存方法研究.pdfVIP

摘 要 软枣猕猴桃 （Actinidia arguta）是我国珍贵的抗寒果树之一，是猕猴桃品种改良的重要种质 资源，其果实富含Vc，营养丰富，是新兴的珍贵果品。目前，其野生资源遭到严重破坏，天然 基因库受到威胁，而常规保存方法如异地保存与组织培养等易受环境及人为影响，保存能力有限， 且占用资源大，因此，探索新的中长期保存方法具有重要意义。超低温保存是目前最为理想且应 用最为广泛的种质资源长期保存的方法。本研究分别以软枣猕猴桃休眠芽、茎尖和花粉为试材， 研究了休眠芽玻璃化超低温保存方法、组培苗茎尖小滴玻璃化超低温保存方法和花粉的离体保 存，旨在建立简单、高效的软枣猕猴桃种质资源保存体系，以期为软枣猕猴桃生产、育种和资源 保存提供参考。 1. 建立了软枣猕猴桃休眠芽玻璃化法超低温保存体系。‘魁绿’单芽茎段最佳的灭菌方法是 茎段去皮后用75%酒精浸泡30 s，无菌水洗涤4～5 次，然后用0.1%HgCl 灭菌30min，无菌水 2 -1 -1 洗涤4～5 次。灭菌后剥取休眠芽放入0.3mol·L 蔗糖 + 1mol·L 甘油的MS预培养液中震荡培 -1 -1 养2 d，常温下用2mol·L 甘油 + 0.4mol·L 蔗糖 +MS 的装载液处理20min，0℃条件下用植物 -1 玻璃化保护液PVS （30%甘油 + 15%乙二醇 + 15%二甲基亚砜 + 0.4 mol·L 蔗糖 + MS）处理 2 120min，换新鲜PVS 保护液后迅速投入液氮冻存。24h 后取出，立即浸入38℃水浴中解冻2min， 2 -1 然后用含 1.2mol·L 蔗糖的MS 卸载液洗涤30min，每10min 换一次卸载液。无菌滤纸吸干后将 -1 -1 休眠芽接种到MS+ 2mg·L 6-BA+ 0.02mg·L NAA 恢复培养基上，暗培养3d，转到正常光照 下培养，成活率达86.30%。用流式细胞仪鉴定再生植株倍性，没有发现差异。用SRAP 分子标记 法鉴定再生植株的遗传稳定性，未发现变异条带。 2. 建立了软枣猕猴桃组培苗茎尖小滴玻璃化法超低温保存体系。无菌条件下剥取2～3mm -1 的 ‘魁绿’茎尖，放入含0.3mol·L 蔗糖的MS预培养液中震荡培养2 d，常温下用装载液处理 40min，0℃条件下PVS 脱水40～60min。将茎尖转入铝箔条上的PVS 液滴中，直接投入液氮 2 2 冻存24h。取出后立即加入40℃预热的卸载液，待铝箔条上的液滴脱落后换新鲜卸载液洗涤30 min。将茎尖用无菌滤纸吸干后接种到恢复培养基中，暗培养3 天后转到光下培养，茎尖的成活 率可达41.11%以上。 3. 以软枣猕猴桃 ‘绿王’的花粉为试材，筛选出花粉离体萌发的最适培养基为5%蔗糖 + 0.04%硼酸 + 1%琼脂，培养基中添加不同浓度硝酸钙对花粉萌发起抑制作用；20℃黑暗条件下培 养，花粉萌发率最高。软枣猕猴桃 ‘绿王’、 ‘A14-5-2’、 ‘B6-1-1’、 ‘T7-3-3’和 ‘T7-6-3’ 等5份种质的花粉在不同低温条件下保存，花粉萌发率以-80℃为最高，-20℃次之，4℃最差。‘绿 王’、 ‘A14-5-2’和 ‘T7-6-3’的花粉在-80℃条件下保存 12 个月，花粉萌发率与保存前无显著 差异，萌发率均在84.96%以上。 关键词：软枣猕猴桃，休眠芽，茎尖，花粉，超低温保存 I