猪肺炎支原体P97蛋白的单抗制备及阻断ELISA抗体检测方法的初步建立.pdfVIP

摘 要 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae ，Mhp ）是造成猪支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae of swine ，MPS ）的主要病原，感染此病原的猪在临床上主要表现为干咳，日增重和饲 料转化率降低等症状，给养猪业带来了巨大的经济损失。同时由于猪群感染该病原后呼吸道黏膜 受损，容易引起其它病原的继发感染而造成较高的死亡率。为有效控制该病原的流行，通过早发 现来进行净化是最好的方法。酶联免疫吸附试验（Enzyme-1inked immunosorbent assay，ELISA ） 是检测血清中抗体最常用的方法，其中阻断 ELISA 方法因为不会受到其它杂蛋白的干扰而具有 相对较高的特异性。 本实验室前期利用酵母展示技术鉴定出了Mhp 的P97 蛋白上主要抗原区P97CR1 。本研究根 据P97CR1 基因序列设计合成特异性引物，通过PCR 方法获得该目的片段，并将其克隆到原核表 达载体pET-28a 中获得重组原核表达载体pET28a-P97CR1 ，利用原核表达系统对该蛋白进行表达 纯化。纯化后的P97CR1 蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫6 周龄的BALB/c 小鼠，当小鼠血清效价达 5 到1.28 ×10 后分离免疫后小鼠的脾细胞，并与SP2/0 细胞融合，通过间接ELISA 方法对阳性杂 交瘤细胞株进行筛选，最终获得了一株分泌抗 P97CR1 蛋白单抗的杂交瘤细胞株 A3 。鉴定结果 显示，A3 分泌的MAb 的重链为IgG1 亚类，轻链为κ链。Western blot 结果显示A3 MAb 能够和 原核表达纯化的P97CR1 蛋白特异性反应，并且在流式细胞仪分析中能够识别天然的Mhp 。通过 逐渐截短表达分析显示该MAb 识别的表位序列为LDDNLQ ，该抗原表位在Mhp 菌株中高度保 守。利用A3 杂交瘤细胞株制备该单抗的腹水，并对腹水中的单抗进行纯化和HRP 标记，采用间 5 接ELISA 方法测得腹水和HRP 标记抗体的效价均为5.1 ×10 。 将P97CR1 蛋白作为包被抗原，用HRP 标记单抗作为二抗初步建立了Mhp 抗体阻断ELISA 检测方法，在建立该方法优化各种条件时发现：抗原最佳包被浓度为 20 ng/ml ；5%脱脂乳为最佳 封闭液；待检猪血清最佳稀释倍数为2 倍；HRP 标记的单抗最佳稀释倍数16000 倍；最佳封闭时 间、血清作用时间、HRP 标记单抗作用时间和TMB 底物作用时间分别为120min，60min，30min 和 10min；根据 51 份阴性血清检测结果确定该方法的判定标准：当样品PI 值≥44.94%，判为阳 性；样品PI 值≤38.86%，判为阴性；38.86%样品PI 值44.94%，判为可疑，当实验结果为可疑 时，需要重新检测1 次，若仍为可疑，则判为阳性。特异性试验结果显示只有Mhp 阳性血清具有 较高的抑制率，而猪鼻支原体（Mhr ）、副猪嗜血杆菌（HPS ）、猪链球菌（SS）、猪圆环病毒2 型 （PCV2 ）、猪流行性腹泻病毒（PEDV ）、传染性胸膜肺炎（APP ）和多杀性巴氏杆菌（PM ）阳性 猪血清没有阻断效果，证明该方法具有较好的特异性。该方法的批内和批间重复性实验的变异系 数均小于 10%，显示较好的重复性。并且该方法与商品化IDEXX 试剂盒的符合率达到91.2% 。 这些结果表明本论文的研究成果为将来开发具有广泛推广前景的Mhp 阻断ELISA 抗体检测试剂 盒奠定了坚实的基础。 关键字：猪肺炎支原体，单克隆抗体，P97CR1 蛋白，P97 抗原区，阻断ELISA I Abstract Mycoplasma hyopneumoniae （Mhp ）is the causative pathogen for Mycoplsma pneumoniae of swine (MPS). After infection by Mhp, the pigs manifests a clearly clinical symptoms such as dry cough, lower