猪德尔塔冠状病毒NH株不同代次基因组特征和致病性分析.pdfVIP

摘 要 猪德尔塔冠状病毒 （Porcine deltacoronavirus, PDCoV ）是近年来新出现的一种引起猪腹泻的 冠状病毒。在2012 年香港首次报道，2014 年在美国猪群中检出并迅速蔓延至美国20 多个州和加 拿大。以水样腹泻、呕吐、脱水和死亡为主要临床症状，给养猪业造成了巨大经济损失。因此分 离病毒并解析其在细胞传代过程中的基因进化特征和致病力差异将有助于PDCoV 致弱的分子机 制研究，对研制弱毒疫苗具有重大意义。 本研究首先对PDCoV NH 株在ST 细胞传代毒株的病毒滴度和噬斑大小进行测定。结果表明 随着传代次数增加，病毒滴度升高。低代次细胞毒产生的噬斑小，高代次细胞毒产生的噬斑大， NH 株在细胞上传代50 次后形成的噬斑大小无明显差异。利用 19 对引物对NH-P 10、NH-P20、 NH-P30、NH-P40 、NH-P50、NH-P60、NH-P70、NH-P80、NH-P90、NH-P 100、NH-P 110、NH- P 120、NH-P 130、NH-P 140、NH-P 150 和NH-P 160 的全基因组进行测序。结果表明NH 株在细胞 传代过程中没有发生碱基的缺失和插入，但是存在核苷酸和氨基酸突变。这些核苷酸和氨基酸突 变散布于基因组的不同区域，主要集中在S 基因。分析结果表明NH 株的毒力强弱可能不是由单 个氨基酸突变作用的结果，而是由多个氨基酸突变共同作用的结果。 为验证 NH 株在细胞传代过程中是否已经致弱，根据全基因组测序结果挑选 NH-P 10、NH- P50、NH-P 100 和NH-P 150 对3 日龄健康仔猪进行攻毒试验。试验结果表明NH-P 10 和NH-P50 攻毒组均出现了严重的腹泻，NH-P 100 攻毒组在整个试验周期1 头仔猪出现一过性的软粪，随即 恢复正常，NH-P 150 攻毒组未出现异常表现。剖检各组仔猪发现NH-P 10 和NH-P50 攻毒组仔猪 小肠肠壁变薄、透明，其内充满黄色水样物质。NH-P 100 攻毒组1 只仔猪可见小肠肠壁变薄，有 黄色液体充盈，另1 只无肉眼可见的损伤。NH-P 150 攻毒组和对照组无异常。组织病理学检测结 果显示，NH-P 10 和NH-P50 攻毒组仔猪小肠绒毛脱落，NH-P 100 和NH-P 150 无明显变化。IHC 结果显示，NH-P 10 和NH-P50 攻毒组病毒主要分布在空肠和回肠的小肠绒毛上皮细胞，NH-P 100， NH-P 150 和对照组均未检到病毒。利用荧光定量PCR 测定各组肠道内病毒载量，结果表明NH- P 10 和NH-P50 各肠段均能检测到病毒核酸且核酸含量较高。NH-P 100 和NH-P 150 也能检测到病 毒核酸，但病毒含量低。对动物体内病毒的S 基因进行测序分析。S 蛋白序列除182、396、616、 707 和797 氨基酸位点外，其余在传代过程中产生突变的氨基酸体内和体外测序结果一致。根据 对 S 蛋白N-糖基化位点和抗原指数预测结果表明高代次毒株（NH-P 100 和NH-P 150）比低代次 毒株（NH-P 10 和NH-P50 ）相比由于162 位和 168 位氨基酸突变造成两个潜在糖基化位点缺失， 并在相应位置抗原指数改变。 总之，本研究通过分析NH 株在ST 细胞传代过程中的全基因组的进化特征，发现随着病毒 在细胞上传代次数增加，基因突变增加。且突变主要发生在S 基因上。动物试验结果表明高代次 细胞传代毒对哺乳仔猪致病力减弱或无致病力。以上研究为研究PDCoV 致弱的分子机制和研发 PDCoV 弱毒疫苗奠定了基础。 关键词：猪德尔塔冠状病毒，病毒致弱，基因组测序 I Abstract Porcine deltacoronavirus (PDCoV) is a new coronavirus which can cause swine diarrhea in recent years. PDCoV was first reported in Hong Kong in 2012. It was detected in US herds in 2014 and quickly spread to more than 20 US states and Canada. Watery