基于反向遗传技术的猪瘟病毒标记C株的构建及其免疫原性评价.pdfVIP

摘 要 猪瘟（classical swine fever, CSF ）是一种以高热稽留和广泛性出血为主要特征的猪的高度传 染性疾病，对我国乃至全球多个国家的养猪业造成巨大的经济损失。目前，我国主要采取免疫接 种猪瘟兔化弱毒疫苗株（C 株或HCLV 株）的措施来预防猪瘟。C 株是一株集良好的安全性和免 疫原性于一身的弱毒疫苗株，在全球猪瘟的防控中发挥了重要作用。但是，现阶段还没有商品化 的标记C 株疫苗可用，这使得在临床上区分野毒感染与疫苗接种 （differentiation between infected and vaccinated animals, DIVA ）还存在一定的技术障碍。因此，我们需要将C 株开发为标记疫苗 株，使其具备标记的特性，在猪瘟净化工作上继续发挥优势。 本实验室前期研究发现，单克隆抗体 （monoclonal antibody, MAb ）HQ06 是CSFV E2 蛋白的 116 122 117 119 122 特异性抗体，并鉴定其识别的抗原表位为 LFDGTNP ，且 F、 G 和 P 是该表位的3 个 关键氨基酸。本研究旨在利用实验室已建立的CSFV 反向遗传操作平台，通过突变LFDGTNP 抗 原表位的关键氨基酸，将C 株开发为标记疫苗。 在本研究中，我们首先利用 CSFV 反向遗传操作平台，以C 株为骨架，将 CSFV E2 蛋白 117 119 122 LFDGTNP 抗原表位的3 个关键氨基酸 F、 G 和 P 分别突变为丙氨酸（A ），构建了3 个突 变 C 株的感染性克隆，并在 SK6 细胞中成功拯救到 3 株突变体病毒 rHCLV-E2F117A 、 rHCLV-E2G119A 和rHCLV-E2P122A 。其次，将构建的3 株突变体病毒感染SK6 细胞，对突变体 病毒的体外生物学特性进行了系统评价。然后，将3 株突变体病毒以耳缘静脉途径分别接种家兔 后，检测突变体病毒在家兔上的定型热反应和脾脏中的复制情况，并评价突变体病毒诱导家兔产 生的抗体能力以及抗体与LFDGTNP 抗原肽的反应性等。最后，将家兔实验中筛选到的具有标记 特性的突变体病毒rHCLV-E2P122A 通过肌肉注射的方式接种断奶仔猪，并评价该病毒诱导仔猪 产生中和抗体的能力以及产生的抗体与LFDGTNP 抗原肽的反应性等。 细胞试验结果表明，本研究构建的3 株突变体病毒均失去了与MAb HQ06 的反应性；3 株突 变体病毒遗传稳定，在SK6 细胞中连续传代20 次后病毒并未回复突变；突变体病毒在SK6 细胞 上的生长能力滞后于亲本病毒，但在感染后60 h ，rHCLV-E2P122A 的病毒滴度可达到于亲本病 毒相当的水平。家兔试验结果显示，3 株突变体病毒均保留了类似亲本C 株诱导家兔产生定型热 反应的生物学特性，突变体病毒在家兔脾脏中复制且并未回复突变；免疫后7 d ，接种突变体病 毒的家兔血清中抗CSFV E2 抗体全部转阳；但是仅接种rHCLV-E2P122A 的家兔血清与LFDGTNP 抗原肽不反应，而接种C 株和其它突变体病毒的家兔血清可与LFDGTNP 抗原肽发生特异性反应。 家猪接种试验结果显示，突变体病毒rHCLV-E2P122A 接种断奶仔猪后，仔猪并未出现任何临床 症状；免疫后28 d，试验组猪只血清中的抗CSFV E2 抗体全部转阳，病毒中和抗体滴度最高可高 于1:240；更为重要的是，接种rHCLV-E2P122A 的仔猪的血清不与LFDGTNP 抗原肽反应，而接 种C 株的仔猪的血清与LFDGTNP 抗原肽存在特异性反应。 122 122 总之，本研究利用CSFV 反向遗传操作平台，将CSFV E2 蛋白 P 定点突变为 A 构建的 突变体病毒rHCLV-E2P122A 在一定程度上赋予了C 株DIVA 的特性，可作为C 株标记疫苗候选 株使用。本研究为研制猪瘟标记弱毒疫苗提供了可行的思路和方法，为我国的猪瘟净化提供了有 力的技术支持。