基于单个B细胞抗体技术研制PRRSV特异性单克隆抗体.pdfVIP

摘 要 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS ）是由猪繁殖与呼 吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV ）引起的一种高度接触 性传染病，临床症状主要是以母猪的繁殖障碍，仔猪呼吸道症状以及哺乳仔猪的高死亡率为特征。 猪群会因感染PRRSV 后所造成的持续性感染以及继发性感染，而导致猪群的生产性能下降，对 养猪业造成了极大的经济损失，是目前影响养猪业健康发展的重要的疫病之一。PRRSV 极易发 生变异，流行毒株众多，而商品化弱毒疫苗的使用，也会导致流行毒与疫苗毒重组现象的发生， 造成PRRS 防控难度加大。诱导保护性免疫应答的PRRSV 抗原结构仍然不是很清楚，有必要研 制PRRSV 不同结构蛋白的单克隆抗体，解析PRRSV 的抗原结构，发现诱导中和抗体甚至广谱中 和抗体应答的抗原表位，为PRRSV 防控产品的研究提供理论依据。 本研究中，利用多种商品化的PRRS 弱毒疫苗和实验室自制流行毒株疫苗免疫猪，以诱导产 生较高水平的中和抗体。同时纯化全病毒抗原，并用生物素标记病毒粒子；在第八次免疫后采集 0922#猪的静脉血，分离外周血中的单核细胞（PBMCs ），以生物素标记的PRRSV 为捕获抗原， 通过流式细胞分选技术，从PBMCs 中分选出抗原特异性抗体分泌单个B 细胞。通过单个B 细胞 抗体基因扩增技术，获得猪IgG 抗体重链和轻链可变区（VH 和VL ）基因序列，然后将可变区基 因序列插入到含有猪IgG 抗体恒定区的pcDNA3.4 真核载体中，构建出完整的抗体表达质粒。将 IgG 抗体的表达质粒，转染适应悬浮培养的中国仓鼠卵巢细胞（CHO-S），进行抗体的小量表达， 然后用间接免疫荧光试验（IFA ）验证小量表达抗体识别PRRSV 的特异性，将特异性反应的抗体 进行大量表达与纯化。纯化后的抗体通过IFA 、微量病毒中和试验（VNT ）、Western blot （WB ） 等试验验证抗体的活性与功能。结果表明，通过蔗糖密度梯度离心，成功纯化出了PRRSV 病毒 粒子，电镜观察病毒粒子呈椭圆形，直径为50-80 nm 。采用不同的弱毒疫苗或自制病毒疫苗反复 免疫后，针对疫苗弱毒VR2332 ，GSWW/15 （HP-PRRSV 样毒株）与GSWW/18 （类NADC30 样 毒株）流行毒的中和抗体效价最高分别可达1:45，1:256，1:45。通过本研究共鉴定出9 株PRRSV 特异性单克隆抗体，9 株抗体均特异性结合PRRSV 的核衣壳蛋白（N 蛋白），均没有病毒中和 活性，IFA 、WB 试验均具有很好的反应性。 综上所述，本研究基于单个B 细 胞抗体技术，获得了9 株PRRSV 特异性单克隆抗体，均识 别PRRSV N 蛋白，说明N 蛋白具有很强的免疫优势性，本研究为筛选PRRSV 中和性单克隆抗 体积累了经验，也为解析N 蛋白中的抗原表位提供了抗体工具。 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒，单个B 细胞抗体技术，流式细胞分选，单克隆抗体 I Abstract Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is a highly contact infectious disease caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). The clinical symptoms are mainly characterized by reproductive disorders of sows, respiratory symptoms of piglets and high mortality of suckling piglets. The persistent and secondary infection due to PRRSV infection will le