基于转基因水sh稻窄叶株系的筛先与鉴定.pdfVIP

摘 要 转录因子是调控基因表达的上游元件。近年来，随着分子生物技术与植物基因 工程研究的不断深入，利用遗传转化将 C4 光合作用途径的转录因子基因转入 C3 植物 中进行基因表达的调控，以期提高C3 植物光合作用效率成为研究热点。 水稻，是一种重要的粮食作物和经济作物。本研究主要利用 Gateway 克隆技术 构建目的基因的表达载体，通过农杆菌介导法将目的基因转入水稻品种日本晴。对 转基因 T0、T1 代植株进行农艺性状、光合作用及内源生长素代谢相关基因的测定， 以探究目的基因对转基因植株的影响。具体研究内容及试验结果如下： 1. 利用 Gateway 克隆技术的 LR 反应，将目的基因连接到目的载体上，构建成 用于遗传转化的表达载体，共构建了 20 个目的基因的表达载体。 2. 利用热激法将表达载体转入大肠杆菌 DH5α。在含壮观霉素的 LB 培养基对转 化后的大肠杆菌进行初筛后，选圆形、乳白色单菌落进行 PCR 检测载体上的目的基 因和潮霉素基因。PCR 产物经测序、比对，验证载体转入大肠杆菌 DH5α。 3. 利用试剂盒进行大肠杆菌 DH5α 内的质粒提取，通过琼脂糖凝胶电泳对质粒 提取结果进行验证。 4. 基于液氮冻融法将质粒导入根癌农杆菌菌株 AGL1 。利用农杆菌介导法将含 目的基因的表达载体转入水稻“ 日本晴” 的愈伤组织中，获得转基因植株。随机选取 转基因植株经 PCR 扩增潮霉素基因检测，均为阳性植株。选取每种转基因的 T0 代 约 40 株移栽大田，4-5 叶期，转 GBP19 基因的 T0 代都表现出明显窄叶性状，GATA29 的部分为窄叶。 5. 转基因 GBP19 的T1 代窄叶性状出现分离，经卡方检验，GBP19 的分离比符 合 3:1 。对目的基因 GBP19 检测，表现窄叶性状的 77 棵植株均含有目的基因，无窄 叶性状的 23 棵植株均无目的基因，表明窄叶性状是由 GBP19 调控的显性遗传。 6. 对 T1 代窄叶株系进行主要农艺性状和光合作用检测与分析，结果表明，窄叶 植株的株高、叶长、叶宽较野生型差异显著，籽粒大小和千粒重无显著性差异，净 光合速率、蒸腾作用、胞间 CO2 浓度及气孔导度均有显著性差异。 7. 对 T1 代窄叶植株中生长素相关基因进行 qRT-pCR 分析，结果是基因 PIN1 、 YUCCA1、LAX1 和 IAA3 的表达量均降低，其中生长素合成相关基因 YUCCA1 表达 量下降最多。初步推测转录因子基因 GBP19 通过调控 YUCCA1，引起窄叶性状。 关键词 水稻；遗传转化；农杆菌介导法；GBP19 基因；窄叶 I II Abstract Transcription factor is upstream element which regulates expression of downstream gene. Recently, with the developing of molecular biotechnology and plant genetic engineering, the genetic transformation of plant is used to transfer transcription factors gene of the C photosynthesis pathway into C plant for the regulation of gene expression, 4 3 and further improving of the photosynthesis efficiency in C3 plant has become a research focus. Rice is an important economic food crop. In this study, the technology of Gateway is used to con