CCK8实验原理与步骤.docxVIP

CCK8 实验 1、在 96 孔板中配置 100μ l 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24 小时（ 37℃， 5% CO2）。 2、向培养板加入 10μl 不同浓度的 待测物质 。 3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如： 6、12、24 或 48 小时）。 4、向每孔加入 10μ l CCK8溶液 （注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD值的读数）。 5、将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。 6、用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。 7、若暂时不测定 OD值，可以向每孔中加入 10μ l 的 HCL溶液或者 1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。 24 小时内测定，吸光度不会发生变化。 PS：1% w/v SDS溶液配制方法： 组份浓度： 10% (W/V)SDS 配制量： 100ml 配制方法： 称量 10g 高纯度的 SDS置于 100-200ml 烧杯中，加入约 80ml 的去离子水， 68℃加入溶解 滴加浓盐酸调节 pH 值至 将溶液定容至 100ml 后，室温保存。 CCK8之前更换 CCK8之前更换 注意：如果 待测物质 有氧化性或还原性的话，可在加 新鲜培养基（除去培养基， 并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 活力计算： 细胞活力 * （％） =[A(加药)-A（空白） ]/[A （0 加药） -A（空白） ] × 100 A（加药）：具有细胞、 CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培养基和 CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度A（ 0 加药）：具有细胞、 CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度 * 细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力 CCK-8 可以用于 细胞增殖 和毒性分析 。其基本原理为 :该试剂中含有WST-8，它在电子载体 (1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料， 生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比 ,因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性 分析。 其使用方法在增殖和毒性试验中有所区别 : 细胞增殖试验 : 1.接种细胞悬液 100 微升于 96 孔板,预先置于 37 度,5%CO2饱和湿度的培养箱内培养 2.在每孔内加入 2.在每孔内加入 10 微升的 CCK-8试剂. 3.把培养板放培养箱内 1-4 小时(根据细胞类型其时间有所不同 ) 4 在 450nm 波长处测定吸光值 ,参比波长为 600nm 或以上波长 . 毒性分析试验 : 接种 100 微升细胞悬液 (5000 个/ 孔)于 96 孔板 预先放置 37 度 5%CO2饱和湿度培养箱培养 24 小时 加入 10 微升不同浓度的毒性物质到孔内培养基 在培养箱内培养 48 小时. 在每孔内加入 10 微升 CCK-8试剂,在培养箱内培养 1-4 小时; 6 在 450nm 波长处测定吸光值 ,参比波长为 600nm 或以上. 以上步骤摘自 CCK-8的说明书 ,由于涉及到某些原因 ,我省去了上面的一些推销用语 ) (内有标价 ,1245 元/1000 孔) 写在前面： 一直都像个新手，从未老道过。所有新手的迷茫与无奈我最能体会。 看到园子里有一些同学在问有关 CCK8试验的事情，当初我也和他们一样，像个被蜘蛛丝缠住头的迷茫苍蝇一头扎进园子里， 期待能找到些解决谜团的只言片语。 希望我写的这些非专业文字能够帮助那些在实验室里没有前行者指点迷津的筒子们。 当然仁者见仁智者见智， 我 写的只是个人实验心得，仅供参考。欢迎大家拍砖共同进步。实验是 写的只是个人实验心得，仅供参考。欢迎大家拍砖共同进步。实验是 简单的，道路是曲折的，时间就是用来浪费的，科研就是自娱自乐使劲折腾。 我没有做过 MTT 实验，但其实原理及目的都是一样的（反应机理不一样）。都说 CCK8简单点而且数据更稳定，所以就用了这个试剂盒。CCK8的说明书大家一定要认真阅读， 里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值， 因为那是反复验证过的最佳数值。 但无论如何， 做这个试验一定要摸条件。你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。以下言论 全部以细胞毒性试验为前提， 如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。 摸条件包括 1、种板数； 2、种板后细胞的贴壁生长时间； 3、加药后的孵育时间； 4、CCK8试剂加入量； 5、CCK8试剂加入后细胞孵育时间。看起来很多，其实这就是一个实验。而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和 CCK8。 1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人