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细菌总数检测 1 定义 食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（ml）检样中形成的微生物菌落总数。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。 2.2 冰箱：2℃～5℃。 2.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。 2.4 天平：感量为0.1g。 2.5 均质器。 2.6 振荡器。 2.7 无菌吸管：1ml（具0.01ml 刻度）、10ml（具0.1ml 刻度）或微量移液器及吸头。 2.8 无菌锥形瓶：容量250ml、500ml。 2.9 无菌培养皿：直径90mm。 2.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2.11 放大镜或/和菌落计数器。 3 培养基和试剂 3.1 平板计数琼脂培养基：见附录中1。 3.2 磷酸盐缓冲液：见附录中2。 3.3 无菌生理盐水：见附录中3。 4 操作方法 4.1 试验前准备 4.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml 4.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min 4.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。 4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。 4.2 样品稀释液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备样品稀释液。样品稀释液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。样品稀释液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 4.2.1 称取25g样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000r/min 均质1min～2min，或放入盛有225ml稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。 4.2.2 以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 4.3 菌落总数测定 4.3.1 用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注于盛有9ml 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 4.3.2 按4.3.1操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。 4.3.3 根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 4.3.4 及时将15ml～20ml冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 4.4 培养 4.4.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h 4.4.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4ml），凝固后翻转平板，按4.4.1 4.5 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。 4.5.1 选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU 4.5.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2 4.5.3 4.6 结果与报告 4.6.1 4.6.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（ml）样品中菌落总数结果。 4.6.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下公式计算： 式中： N——样品中菌落数； ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。 4.6.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以