分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术.pptVIP

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2020-11-06 发布于安徽
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分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术.ppt

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酶联免疫斑点(ELISPOT)技术 ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况；用抗体原位捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。特点：斑点可持久保存并进行计数分析易操作、有效、快速、灵敏度高细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分析系统进行快速、客观的分析 Coating Ab 包被培养孔根据实验设计加入淋巴细胞及含或不含刺激因子的培养液孵育基本原理活化的淋巴细胞可分泌细胞因子与Coating Ab结合洗除细胞，依次加入生物素标记的抗细胞因子抗体及酶标抗生物素抗体进行反应加入酶底物显色形成斑点（SPOT） Coating Ab 包被培养板每孔加入200ul培养基封闭按实验设计加入含或不含刺激剂的培养液及一定数目细胞孵育20-24小时 40C过夜室温孵育1小时无菌直接取外周血单核细胞或脾淋巴细胞基本操作去除细胞加入生物素标记的detector Ab 加入酶标抗生物素抗体(GABA) 加入显色剂I/II, 暗处室温孵育20-30分钟 PBST洗板室温孵育2小时后，PBST洗板室温孵育1小时后，洗板去离子水清洗培养板室温干燥后在倒置显微镜下观察结果非无菌技术要点预孵育的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液过黄）会影响斑点的形成提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞的干扰加入ELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液细胞孵育过程应保证ELISPOT培养板静置，CO2培养箱应保证稳定，避免震荡稀释抗体及GABA冻干粉时建议无菌操作，保存过程避免细菌的污染以保证其效用显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合 ELISPOT 实验结果示意图双色ELISPOT原理双抗体包被培养细胞细胞因子A 细胞因子B 包被抗体 HRP-检测抗体 Biotin-检测抗体碱性磷酸酶- streptavidin BCIP/NBT底物 AEC底物斑点形成细胞因子A 细胞因子B 双色ELISPOT结果示意图蓝色：IFN-γ,红色：IL-2; 蓝色：IFN-γ,红色：IL-17 B细胞杂交瘤的筛选化合物和药物免疫学反应的检测优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性靶向疫苗的质控自身免疫疾病的诊断和预后分析自身免疫疾病免疫治疗的监控过敏性疾病的脱敏治疗的监测器官移植中排斥反应的预测微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析结核病的诊断 ELISPOT方法主要用途 * *