实体瘤组织单细胞悬液制备.pdfVIP

。 实体瘤组织单细胞悬液制备及培养方案 一、 单细胞悬液制备 ( 一 ) 仪器、材料及试剂 1. 仪器： (1) CO 2 培养箱（调至 37℃），离心机，水浴锅（ 37℃），血球计数板； (2) 无菌器械：细胞培养瓶， 50 ml 离心管，平皿，吸管，移液管，纱布， 200 目/ 300 目尼龙滤网，手术器械。 2. 材料：肿瘤造模成功的大鼠 3. 试剂： RPMI1640 培养基（含 10%小牛血清） ，0.25%胰酶， Hank’s 液/PBS 缓冲 液，碘酒 附： Hank’s 液配方： KH2PO4 ：0.06g ；NaCl ：8.0g ；NaHCO3 ：0.35g ；KCl ：0.4g ； Glucose ： 1.0g ； Na 2HPO4 ·H2 O：0.06g ； 加 H2O 定容至 1000 ml 注： Hank’s 液可以高压灭菌， 4℃下保存。 ( 二 ) 操作步骤 机械 - 胰酶消化法 1. 取材： 制备实体瘤单细胞悬液， 肿瘤取材部位非常重要， 体积较大的肿瘤组织 中有退变或坏死区， 取材时尽量避免用退变组织， 挑选活力较好的部位。 将大 鼠麻醉，置 75%酒精泡 3-5 min （时间不能过长，以免酒精从口和肛门浸入体 内），固定后再用碘酒消毒腹部， 带入超净台内解剖取肿瘤组织， 置于平皿中。 2. 用 Hank’s 液 /PBS 缓冲液洗涤三次，并剔除周围脂肪、结缔组织、血液等。 3. 用无菌眼科手术剪将肿瘤剪成小块（ 1-2 mm），再用 Hank’s 液/PBS 缓冲液洗 涤三次，转移至 50 ml 离心管中。 4. 视组织块量加入 5-6 倍的 0.25%胰酶液， 37℃中消化 20-40 min ，每隔 5 min 轻轻振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 5. 加入 2-5 ml 含血清培养基，以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂） 。 6. 静置 2-3 min ，使未分散的组织块下沉，将悬液转移到新的离心管中。 7. 用 200/300 目尼龙网过滤悬液 2 次。 8. 将过滤后悬液 1000 rpm ，离心 5-10 min ，弃上清液。 9. 加入 Hank’s 液/PBS 缓冲液 5 ml ，轻轻冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 10. 视细胞量加入 l-2 ml 培养液，血球计数板计数。 5 11. 将细胞调整到 5 ×10 /ml 左右，转移至 25 ml 细胞培养瓶中， 37℃下培养。或 者直接用作流式分析及其他分析。 二、 实体瘤组织中抗癌药物含量检测 1. 按上述取材步骤取出合适的肿瘤组织，分成 A、B 两份，分别置于含有 1-2 ml PBS 精选资料，欢迎下载 。 缓冲液的无菌离心管中（离心管及 PBS 液已称重） ，准确称量肿瘤组织的重量。 A 组可直接用于检测组织中抗癌药物的含量， B 组用于检测细胞内抗癌药物含量。 2.