基因工程第五章目的基因的获取.pptVIP

第五章 目的基因的获取;;目的基因的获取;第一节 基因组DNA片段化;由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。;二、随机片断化;1）4bp的内切酶;2. 机械切割法;1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。;由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列;一、目前常用的方法;① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH;（2）合成过程;原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接，然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具体的合成和延伸过程如图。;2020/11/5;化学合成的DNA片断一般在200bp以内。;T4 DNA连接酶;2. 互补延伸连接法;1. 直接合成基因;DNA合成仪;第三节 PCR扩增获得目的基因;PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大;第四节 从基因文库、cDNA文库获取目的基因;一、基因文库的构建;组织或细胞染色体DNA;（2）目前常用的载体 ;断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。;（2）载体与基因组DNA大片段的连接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接;目的基因;5′ 3′;人工接头及其应用;;4. 基因组文库的大小;若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106 克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若 用λ噬菌体载体可 构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所 需要的重组体克隆数可以减少到9×105, 而要用柯斯质粒将 40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右, 均可满足建库要求。;1.cDNA library;（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。;分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。 ;2020/11/5;反转录酶;随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ： 根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端??oligo(dT)引物一处开始。 ;用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。;③ cDNA第二链合成;cDNA第一链;去掉发卡结构;b.置换合成法：;优点：a）合成cDNA的效率高 b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化 c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA;c.引导合成法：;d.引物-衔接头法;在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。;;5. cDNA文库的大小;基因组DNA文库;1 基因组DNA文库的优点;2 cDNA文库的主要优点;3 cDNA克隆的主要的缺点;四、基因文库的筛选与鉴定;1、表型筛选法;（二）基因文库的鉴定