从口腔脱落细胞中提取人类基因组DNA.pdfVIP

. 从口腔脱落细胞中提取人类基因组 DNA 一．实验目的 1 、了解从细胞中提取 DNA的基本原理 2、学习从口腔脱落细胞中提取高分子量 DNA的基本操作步骤和会影响提取效 果的注意事项。 二．实验原理 1. 用蛋白酶 K （使膜上蛋白变性分解）和去污剂 SDS（破坏细胞膜的脂质结 构）共同消化细胞。 2. 然后酚、 氯仿等有机溶剂进行抽提， 进行 DNA的纯化，去掉蛋白质、 RNA、 多糖等生物大分子。 3. 最后用无水乙醇沉淀 DNA，干燥后用 TE溶解，在 4 ℃下可保存一年。 三．实验步骤 1、先用清水漱口。然后用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌 出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用 1ml 生理盐水洗涤，后将 1.5ml 液体 转入 1 个干净的 EP管中， 2000rpm 离心 5 分钟，倒掉上清。 2、重复用 1.0ml 生理盐水洗涤沉淀 1 次，离心，去上清。 3、沉淀中加 500 μl 1x 细胞裂解液（ STE），打散细胞团、混匀，再加 15 μ l 20mg/ml 蛋白酶 K，充分混匀。 55 ℃水浴 30min。 4、加 500 μl 饱和酚，轻摇混匀，室温 12000rpm离心 10min。 5、上清（注意不要吸到中间层白色絮状物质以及下层有机相）移至另一加 入装有 500 μl 氯仿的 EP管，轻摇混匀，室温 12000rpm离心 10min。 6、吸取 400 μl 上清（注意不要吸到中间层白色絮状物质以及下层有机相） 至已装有 900 μl 预冷无水乙醇的离心管，混合均匀，可见白色絮状沉淀， 10000rpm离心 5min ，DNA沉淀在管底。 7、去上清，加入 70%乙醇 1ml 清洗沉淀， 10000rpm离心 5min ，去上清（尽 量用小枪头将液体去干净，但注意不要将沉淀也吸走） ，室温干燥 5min，再用 50 μl TE buffer 溶解沉淀， 4 ℃储藏备用。 四．实验结果 1 / 3 . 五．结果分析 编号： 100 如图所示， 100 号几乎没有提取出 DNA，只有很弱的一条带，如果量再多一 些的话，应该也看得到会有几条带。 经过分析后认为主要以下几点原因： 【1】. 唾液稀释过度，导致取到的细胞 很少。【2】. 在破碎细胞的时候进行的不彻底， 没有混匀， 导致 DNA抽提不完全。 【3】. 加入活性去污剂到加热 30min 的间隔有些长导致部分 DNA被 DNA水解酶 降解。【4 】. 加入饱和酚的时候没有摇匀，蛋白质的去除不彻底，部分 DNA与蛋 白质结合，在分离 DNA去除蛋白质的时候损失了不少 DNA。 此外，不同的条带代表提取出的 DNA的大小不同，在实验过程中，可能由于 剧烈震荡，或 DNA水解酶的缘故使得 DNA链被打断。因此出现了不同的几个条 带。 六．注意事项 1. 取唾液时既不能过分稀释，也不能太粘稠，发现细胞不足时要及时补充。 2. 裂解细胞的时候，要充分混匀活性去污剂，但震荡也不能太剧烈。最好及