分子生物学-12-1-第六章 基因功能研究方法-1.docVIP

PAGE 郜刚分子生物学教案 山西师范大学 教案 课程名称： 分子生物学 课程类型： eq \o\ac(□,√) 理论课 □理论、实践课 □ 实践课 学 时： 52 学 分： 2 授课教师： 郜刚 授课班级： 授课学期： 20 至20 学年第 学期 教材名称： 朱玉贤 分子生物学3rd 参考资料： 1．Benjamin Lewin 《Genes VIII》 2．：[英] P.C.特纳 A.G.麦克伦南 A.D.贝茨 M.R.H.怀特 Instant Notes in Molecular Biology 3． 韦弗（Robert F．Weaver）Molecular Biology  第六章 基因功能研究技术 6.1 转录组测序 什么是转录组？ 某生物某特定生理条件下某个细胞或者组织中全部RNA；特指全部mRNA. 转录组研究的方法 传统方法（基于Sanger 测序技术的）： 表达序列标签 expressed sequence tag,EST 基因表达序列分析 Serial Analysis of Gene Expression, SAGE 新方法（基于新测序技术的） 454, solexa, SOLiD 5.6蛋白质组学的研究方法和进展page187 6.1 基因表达研究技术 6.1.1 基因表达系列分析技术 特点： SAGE是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。 原理：任何长度超过9-10个碱基的核 苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产 物，因此，将这些9-10碱基序列作为该转录物的标签，根据这个标签占总转录物的比例 可分析所对应基因的表达频率 应用：干什么的？一个细胞中到底有多少种基因在表达 基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)定义 是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法。分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约9-14个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。 SAGE是一种同时检测许多基因在同一时间、同一细胞中的表达及其水平的一种方法。其理论依据在于“cDNA的同一种限制性内切酶位点旁边的9核苷酸序列可以作为代表一种cDNA的标签”。 因为，几乎不可能有两个基因cDNA的同一个酶切位点旁边的9个核苷酸完全相同，也就是说，相同的9核苷酸同时出现的概率是1/49＝1/262144，而细胞中表达基因的数目远小于这个数。 所以当检测到细胞中有多少种9核苷酸序列时，就可以判定有多少基因在表达，其表达产物的多少就反映了其表达水平的高低。 6.1.2 RT-PCR法研究RNA的选择性剪接 RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。 平衡剪切 5’ 3’ 外显子遗漏型剪切 相互排斥性剪切。 RT-PCR法可以研究某个基因是否存在选择性剪切。 6.1.3原位杂交in situ hybridization 原位杂交（ISH）是 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射 检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体 上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段. 先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。 检测基因表达的常用RNA和染色体原位杂交两大类。 RNA原位杂交:用放射性或非放射性（如地高 辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基 因的表达产物做出定性定量分析。 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH) FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。 将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，来确定该DNA序列在染色体上的位置。 6.1.4 基因定点突变技术 概念：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列 作用：用于研究基因产物功能： 氨基酸残基对蛋