分子生物学-12-2-第六章 基因功能研究方法-2 蛋白质互作研究方法.docVIP

PAGE 郜刚分子生物学教案 6.3 DNA/蛋白质/RNA 6.3.1 酵母单杂交系统 酵母单杂交系统是在双杂交系统基础上发展而来的，研究蛋白质与DNA间相互作用的实验研究系统 目前酵母单要交体系已被广泛应用于寻找与特定的目的ＤＮＡ片段相互作用的蛋白质分子 单杂交系统的原理 在报告基因上游加入已知的DNA顺式元件（结合位点）序列或随机DNA片段，将未知蛋白基因(或cDNA文库)与DNA激活域AD构成融合基因，将两者转入酵母细胞，通过报告基因有否转录，判断蛋白质与DNA有否相互作用。 6.3.2 The yeast two-hybrid system 典型的真核转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain,BD) 识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域(transcription-activating domain,AD) 转录激活结构域配合其他成分、构成转录复合体，启动它基因的转录。 转录因子的结构域的特征 单独地BD能与特定基因地启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。 这两个结构域不但可在其连接区适当部位进行拆分并保持各自的功能,而且不同的两结构域还可进行重建并发挥转录激活作用。 酵母双杂交系统的最基本原理 酵母双杂交系统的原理就是利用了两个结构域的拆分和重建，来鉴定蛋白质之间的相互作用的哦。 将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体， 同时将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体， 然后将两个杂交体转染酵母细胞，这个酵母细胞含有一个报告基因，报告基因上游存在转录因子的结合位点， 若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。 因此，可通过检测报告基因的转录与否来研究蛋白质x和Y的相互作用 。 酵母双杂交系统的应用 ①已知蛋白质之间相互作用检测 ②未知蛋白质的功能研究： ③克隆新基因、新蛋白： ④研究蛋白质相互作用网络 ⑤药物筛选 6.3.3体外蛋白质相互作用技术简介 1、Far Western blotting Far-Western 印迹：Far-Western印迹最初发明用于32P标记的GST-融合蛋白表达文库的筛选，现在则用于检测蛋白质-蛋白质相互作用 2、GST融合蛋白沉降技术 利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和， 离心，沉降，分离，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。 3、蛋白质芯片技术 蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点。 4、等离子表面共振技术 将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有靶蛋白同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。 5、免疫共沉淀技术 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。 6. 细胞内蛋白质相互作用研究—荧光共振能量转移法（FRET） FRET荧光能量转移有三个基本条件： （1）给体与受体在合适的距离（1～10 nm）； （2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）； （3）给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。 6.3.5 RNA干扰技术 又叫RNA干涉 又叫RNA沉默 RNAi技术 一些小的双链RNA（dsRNA）可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，即称为RNA干扰（RNA interference, RNAi，也称RNA干预或干涉或沉默）。 它是生物体内抵御外在感染的一种重要保护机制 介导细胞内序列特异性基因表达阻断或封闭，也就是转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）,从而起到控制细胞的各种高级生命活动 RNA干扰（RNA interference，RNAi） 内源性或外源性双链RNA介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。 RNAi 抑制基因表达的机理 6.4 基因芯片：讲过了 其中的数据