荧光光谱分析实验讲义.pdf

。 实验 荧光光谱分析 一、实验目的与要求： 1. 了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用； 2. 掌握荧光分光光度计的工作原理； 3. 掌握激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试方法。 二、基本概念 1. 发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。 发射光谱中，横坐标为波长（或频率） ，纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱 ，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。 2. 激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长 （或频率）变化的曲线。 横 坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。 即表示发光的某一谱 线或谱带可以被什么波长的光激发、 激发的本领是高还是低； 也表示用不同波长 的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。 3. 余辉衰减曲线 是指激发停止后发光强度随时间变化的曲线。 横坐标为时间， 纵坐标为发光强度 （或相对发光强度）。 三、测试仪器 激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试采用日本岛津 RF-5301PC型荧光 分光光度计。 从 150W氙灯光源发出的紫外和可见光经过激发单色器分光后，再经分束器 照到样品表面， 样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光， 再经荧 光端光电倍增管倍增后由探测器接收。 另有一个光电倍增管位于监测端， 用以倍 增激发单色器分出的经分束后的激发光。 光源发出的紫外 - 可见光或者红外光经过激发单色器分光后，照到荧光池中 的被测样品上，样品受到该激发光照射后 发出的荧光经发射单色器分光，由光 电倍增管转换成相应电信号， 再经放大器放大反馈进入 A/D 转换单元，将模拟电 信号转换成相应数字信号，并通过显示器或打印机显示和记录被测样品谱图。 四、样品制备 液体试样 液体试样应放入专用的液体样品槽中，固定到样品座中。 五、测试过程 （一）RF-5301PC荧光分光光度计测试发射、激发光谱及余辉衰减曲线步骤 先开机：打开 Xe 灯开关 和 主机开关。开电脑。双击 电脑桌面的 “RFPC”程 序快捷键 进入测试程序， 会出现 初始化界面， 仪器依次检测 ROM、RAM、EEPROM 激发狭缝、发射狭缝、激发单色器、发射单色器和基线，初始化完成后，进入到 测试界面。 精选资料，欢迎下载 。 1. 发射光谱的测试 第一步：参数设置。 点击 Configure 设置 / Parameter 参数，进行测试参数设置： (1) 第一行为光谱类型。选择“ Emission ”发射光谱 (2) 第二行为激发波长。输入激发波长 (3) 第三行为发光波长范围。 输入扫描的起始波长和终止波长 （对于未知样，也 可选择可见光全波段 400~760nm） (4) 第四行为记录范围。输入纵坐标的最小和最大显示值 (5) 第五行为扫描速度。由快至慢有 6 种速度选择 (6) 第七行为狭缝宽度。 可分别选择 激发和发射狭缝 宽度，对于发光较弱的样 品，测试时可以适当增大狭缝宽度。 (7) 第八行为测试灵敏度选框。 (8) 第九行为响应时间选框，由快至慢有 9 种速度选择 (9) 参数设置完成后，点击“ OK”。 第二步：光谱测试。 点击屏幕右下角“ Start