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细胞自噬的研究方法 正常培养的细胞自噬活性很低， 不适于观察， 因此， 必须对自噬进行人工干预和调节，经报 道的工具药有： 一、自噬诱导剂 (1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激 (2) Carbamazepine/ L-690 ，330/ Lithium Chloride （氯化锂） ：IMPase 抑制剂（即 Inositol monophosphatase ，肌醇单磷酸酶） Earles 平衡盐溶液：制造饥饿 (4) N-Acetyl-D-sphingosine （C2-ceramide ）： Class I PI3K Pathway 抑制剂 (5) Rapamycin ： mTOR 抑制剂 (6) Xestospongin B/C ： IP3R 阻滞剂 二、自噬抑制剂 (1) 3-Methyladenine （3-MA ）：（ Class III PI3K ） hVps34 抑制剂 (2) Bafilomycin A1 ：质子泵抑制剂 (3) Hydroxychloroquine （羟氯喹）： Lysosomal lumen alkalizer （溶酶体腔碱化剂） 除了选用上述工具药外， 一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预： 包括反义 RNA 干扰技术（ Knockdown ）、突变株筛选、外源基因导入等。 三、自噬过程进行观察和检测 细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有： 1、观察自噬体的形成 由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。 Phagophore 的特征为：新月状或杯状， 双层或多层膜， 有包绕胞浆成分的趋势。 自噬体（ AV1 ）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自 噬溶酶体（ AV2 ）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（ autophagic vacuole ， AV ） 2、在荧光显微镜下采用 GFP-LC3 融合蛋白来示踪自噬形成 由于电镜耗时长，不利于监测（ Monitoring ）自噬形成，人们利用 LC3 在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。 无自噬时， GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中； 自噬形成时， GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。 3、利用 Western Blot 自噬形成时，胞浆型  检测 LC3-II/I 比值的变化以评价自噬形成 LC3 （即 LC3-I ）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即 LC3-II ），因此， LC3-II/I 比值的大小可估计自噬水平的高低。 （注意： LC3 抗体对 LC3-II 有更高的亲和力，会造成假阳性。方法 时需考虑溶酶体活性的影响。）  2 和  3 需结合使用，同 4、检测长寿蛋白的批量降解：非特异 5、 MDC （ Monodansylcadaverine ，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。 6、 CellTrackerTM Green 染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。 四、自噬相关蛋白的定位 在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位： Lamp-2 ：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。 LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。 pDsRed2-mito ：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白 +线粒体基质定位信号）， 可用来检测线粒体被自噬掉的程度（ Mitophagy ）。 MitoTraker 探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。 Hsp60 ：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。 Calreticulin （钙网织蛋白）：内质网腔 （注意：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜 （permeablize ），可采用 0.1%SDS 处理。）