临床基因组学：第六章 多重连接探针扩增技术及片段分析技术.ppt

四、片段分析技术的临床应用 主要用来检测动态突变（dynamic mutation）： 动态突变是指DNA中的核苷酸（主要为三核苷酸）重复序列的拷贝数发生扩增而产生的突变。 重复序列的大小从3个碱基到33个碱基长不等。 在基因的编码区、3’或5’-UTR、启动子区、内含子区出现三核苷酸重复，及其他长短不等的小卫星、微卫星序列的重复拷贝数。 四、片段分析技术的临床应用 动态突变 在减数分裂或体细胞的有丝分裂过程中发生扩增而造成遗传物质的不稳定状态。 动态突变伴随着世代的传递而不断扩增，重复序列的拷贝数越来越多，在达到一定的倍数后就导致疾病的发生，其发病率和疾病的严重性也逐代升高加重。 四、片段分析技术的临床应用 动态突变 例如，1型强直型肌营养不良（DM1）是由DMPK基因（19q13.3）的CTG重复数扩增而引起的，正常人重复数为5-34次，遗传不稳定正常等位基因为35-49次，全突变则≥50次，病情严重者甚至在2000次以上。 DM1的诊断需联合应用std-PCR和TP-PCR技术。 一、片段分析技术原理 二、片段分析技术特点 三、片段分析技术实验操作、结果分析 四、片段分析技术的临床应用 第六章 第二节 片段分析 目录 《临床基因组学检验》 五、片段分析技术常见问题 五、片段分析技术常见问题 （一）如何选峰？ （二）如何读峰？ 常见的问题是峰型复杂 初学者不知道该如何选择、读取 峰型的选择 单峰形态： 可由主峰、stutter峰组成，若STR位点重复数目较大时可以产生Stutter+峰，Size大于主峰； stutter峰的特点是，相邻的stutter峰之间、与主峰之间Size差别总是重复片断的整数倍。 主峰、stutter峰均有可能产生由于Taq酶加A/不加A引起的N/N+峰形。 峰型的选择 双峰形态： 两个单峰Size较为接近时，Size较大的峰所产生的Stutter峰与Size较小的主峰发生重叠。 双峰峰形应该与单峰峰形区分开来。 （一）如何选峰？ 由于扩增时会出现stutter峰及±A峰，一般规定选择最高峰作为等位基因的片段。 （一）如何选峰？ 峰型选择-1 峰型选择-2 峰型的选择-3 2a、2b、2c、2d、2e为单峰形态2f、2g、2h为双峰形态 （二）如何读峰？ 1、原则上读取主峰的Size；出现N/N+峰形时，可根据具体的情况读取N峰或N+峰，但应该统一。 （二）如何读峰？ 2、遇到存在Stutter+峰的情形，首先找到整个峰中最高的2个峰，读取Size最大者。 重点回顾 1、FA的定义 2、FA的原理 3、FA的实验步骤 4、FA的临床应用 第六章 第二节 片段分析(FA)技术 谢谢聆听！ 临床基因组教研室 莫桂玲 邮箱：labmgl@ 最早由荷兰科学家Dr. Schouten JP于2002年提出。 是一种高通量的基因检测方法，该技术利用简单的杂交、连接和 PCR 扩增反应，可以在同一反应管内对多达45种不同的核苷酸序列进行检测和定量分析。 其原理是利用可与样本DNA正确杂交并被连接酶连接的探针进行扩增和定量分析。 * * 针对每一个待测靶基因序列，均有一对MLPA探针，其由一个短的寡核苷酸片段（短探针）和一个长的寡核苷酸片段（长探针）组成。 短探针： 经化学合成（5 端探针） 长约50-60 bp，包括一个位于其3 端并与靶序列完全互补的杂交序列和一个位于其5 末端19 nt 的共同序列，该共同序列与标记的PCR 引物相同。 长探针： 经M13 噬菌体衍生法制备（3 端探针） 长探针长约60-450 bp，包括一个位于其5 末端并与靶序列完全互补的杂交序列和一个位于其3 末端23 nt 的共同序列及两序列间的长度特异填充片段，其共同序列与未标记的PCR 引物相互补。 * 一、MLPA技术概述 二、MLPA技术原理/实验操作/结果分析 三、MLPA技术临床应用 四、MLPA技术特点 第六章 第一节 目录 《临床基因组学检验》 五、MLPA技术新发展 MLPA compared to other techniques MLPA优点 MLPA技术融合了DNA探针杂交和PCR技术的特点，且发扬了其连接依赖的特色，其优点： MLPA不足 1）不能探测染色体结构异常； 2）不能反映染色体的平衡易位和倒位现象； 3）目前尚不能用于单个细胞标本的检测； 4）进行染色体三体检查时，被污染的羊水样本不能用于检测； 5）尚不能用于检测短串联重复序列多态性（STR）； 6）尚不能检测未知的点突变； 7）探针设计来源于M13-Holland，耗时且困难。 一、MLPA技术概述 二、MLPA技术原理/实验操作/结果分析 三、MLPA技术临床应用 四、