分子生物学实验操作方法和技巧.pptVIP

分子生物学与生物化学实验 操作、设计与技能 电泳技术 李則副教授  contents 电泳的原理 影响迁移率的几大因素 低熔点琼脂糖的优点 4不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围 电泳缓冲液 中山大学学图  contents 6 凝胶载样缓冲液 电泳步骤 法 凝胶中DNA定量的方 两种核酸染色方法 10 电泳的主要用处 中山大学学图  contents 核酸回收的几种经典方法 电泳切胶小窍门 中山大学学图  电泳的原理 ?带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。 ?利用带电样品分子(DNA、RNA、蛋白质等) 在电泳裝置中的支持介质上(琼脂糖、聚丙 酰酰胺等)迁移率(带电荷颗粒在一定电场 强度下,单位时间内在介质中的迁移距离) 的不同而将样品中不同大小的分子分离开。 中山大学学图  影响迁移率的几大因素 ?1、DNA分子的大小。分子越大,迂移得越慢。 ?2、琼脂糖浓度。给定大小的线性DNA片段在越低 浓度琼脂糖的凝胶中迁移率越快。 ?3、DNA的构象。一般超螺旋DNA(型)切口环 状DNA线状DNA,但在一些情况 顺序可能 顶倒。所以确定DNA的大小,很多时候要依靠 Marker(分子量标记)。 ?4、溴化乙锭(B)。EB插入双链DNA造成其负电 荷减少、刚性和长度增加。因此线状DNA-染料复 合物在凝胶中的迁移率约降低15% 中山大学学图  影响迁移率的几大因素 ?5、所用的电压。低电压时,DNA片段迁移率与 所用的电压成正比。电场强度升高时,高分子质 量片段的迁移率不成比例的增加。所以当电压增 大琼脂糖凝胶所分离的有效范围反而减少。要获 得大于2 Kb dna片段的良好分辨率,则所用电 压不得超过5-8V/cm ?6、琼脂糖种类。常见的琼脂糖主要有两种∶标准 琼脂糖(ω Agarose)和低熔点琼脂糖(LMP Agarose)。—般低熔点琼脂糖比标准琼脂糖具 有更佳的分辨率。 中山大学学图  琼脂糖品牌的推荐 ?一般来说,琼脂糖的品牌对电泳结果影响不大 旦好的琼脂糖做岀来的胶韧性比较好,照出来的 照片效果好,很清晰,背景很干净。 享:最好用的琼脂糖品牌: Sigma,日本的一 ,强度也很高。性价比比较高的有 BioWest Agarose_(西班牙品牌),这几乎是目 前国内使用最普遍的一种琼脂糖。另 Promega的 Agarose不好用,强度较差。 中山大学图  Agarose和Agar的区别 注意: Agarose和Aqar的区别 ?琼脂糖( Agarose)是经过挑选 为原料而制成的。琼 和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一含有硫酸根和羟基的 多糖,它具有离子交换性质,这种性质会给电泳及凝胶过 滤以不良的影响。琼脂糖是直链多糖,它由D-半乳糖和 3,6-脱水--半乳糖的残基交替排列组成。琼脂糖主要通过 氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水量大(98-99% 近似自由电泳,因为固体支持物的影响少,故电泳速度快 区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团,电渗影响 很少,是一种较好的电泳材料,分离效果较好。 ? Agarose-般仅用于申泳实验,当然如果不怕浪费的话, 也可以用于配固体培养基。效果很好! ?Aqar一般仅用于配固体培养基,绝对不能用于电泳! 中山大学刚  低熔点琼脂糖的优点 ?标准琼脂糖一般凝结温度在40-42?C,烙化温度 在85-90度。低熔点琼脂糖一般凝结温度在25- 35?C,熔化温度在63-657℃,甚至更低 在30-357仍呈液态,所以在回收胶内的DNA时 热溶解胶后不损伤DNA。另外它比标准(普通 琼胪糖有更高的筛分能力。其分辨率接近聚丙烯酰 胺凝胶,因此可用于PCR产物、小片段DNA和小 RNA(1kb)的分离。现在它能分辨少至4bp的 DNA和分离200-800bp范围内相差2%的DNA片 段 ?但低熔点琼脂糖价格非常昂贵,远髙于标准琼脂糖。 山大学学图