血红蛋白的提取和分离-学案.docxVIP

§ 5.3《血红蛋白的提取和分离》导学案 班级：高二()班姓名： 【学习目标】 1?概述凝胶色谱法、电泳法分离大分子的基本原理。 2?知道缓冲溶液的作用。 3?尝试对血液中血红蛋白进行提取和分离 ，体验从复杂体系中提取生物大分子的基础过程和方法。 4?掌握对样品的预处理、色谱柱制作及装填等操作 ，进行样品的加入和洗脱并最终分离出血红蛋 白。 【自主学习】 一、基础知识 蛋白质的分离依据： 蛋白质特性的差异,如分子的形状和 、所带 的性质和多少、溶解度、 和对其 他分子的亲和力等。 凝胶色谱法： 概念:也称做 ,是根据 分离蛋白质的有效方法。 凝胶的特点形态： 微小的 组成：大多数由 构成 结构:内部有许多 常用凝胶: 和琼脂糖。 分离原理。 相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 ，路程 ,移动速度 ,通过凝胶的 时间 。 相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 ，只能在凝胶 移动,路程 ,移动 速度 ,通过凝胶的时间 。 缓冲溶液： 作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制 对溶液pH的影响，维持pH基本不变。 ⑵ 配制：通常由1?2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 就可以制得 的缓冲液。 (3)意义：为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程 ，保持 与体内环境中 的pH基本一致。 电泳： (1)概念:带电粒子在 的作用下发生 的过程。 ⑵原理。 带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 的基团，在一定的pH下,这些 基团会带上 。 迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其 的电极移动。 分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生 ,从而实现样品中各种分子的分离。 (3)常用的电泳方法： 电泳和 电泳。 二、实验操作 样品处理： (1)红细胞的洗涤。 TOC \o 1-5 \h \z 目的:去除 。 方法: 。 标准：直至上清液不再呈现 。 ⑵血红蛋白的释放。 红细血一川入?釧脈血液的库枳一-為;亦*癒力搅种器上 報虻恠租的卩星 搅丼-吧血红蛋白释液。 (3)分离血红蛋白溶液。 1/min 离*4 min 方法：混合液 ==——?分层。 分层结果(自上而下): 第1层:无色透明的 。 第2层:脂溶性物质的 ――白色薄层固体。 第3层: 的水溶液一一 透明液体。 第4层:其他杂质的暗红色沉淀物。 结果处理：将试管中的液体用 过滤，除去 沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后 ，分出 下层的 液体。 透析——粗分离： (1)过程：取1 mL的 溶液装入 中，将其放入盛有 300 mL的物质的量浓度为 20 mmol/L 的 中（pH 为 7.0）， 透析 h。 (2)原理:透析袋能使 自由进岀 ，而将 保留在袋内。 ⑶目的：去除样品中 的杂质。 3.凝胶色谱操作 纯化： (1)凝胶色谱柱的制作 1 (2)凝胶色谱柱的装填 :凝胶用 充分溶胀后，配 成凝胶悬浮液， 缓慢倒入凝胶色谱柱内 ⑶样品 ①加样前：打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面 ，关闭出口 的加入 ②加样：用吸管小心地将 1 mL透析后的样品加到色谱柱的 ，注意不要破坏凝胶面 加样后：打开下端出口，使样品渗入 内 ⑷ 洗脱: 下端出口，加入磷酸缓冲液，连接 , 下端出口，进行洗脱 4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳一一纯度鉴定： 判断纯化的蛋白质是否达到要求 ，需要进行 的鉴定。鉴定方法中 ，使用最多的是 三、操作提示 红细胞的洗涤： 、离心速度与 十分重要。洗涤次数过少，无法除去 蛋 白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀 ，达不到分离的效果。 色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在 中膨胀,可以将加入洗脱液的湿凝胶用 沸水浴加热，加速膨胀。 凝胶色谱柱的装填 ：在装填凝胶柱时 ，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的 TOC \o 1-5 \h \z ,降低 。 蛋白质的分离：如果红色区带 ,说明色谱柱制作成功。 【预习小测】 相对分子质量较大的蛋白质 ，无法进入凝胶内部的通道，移动速度较慢。 （） 凝胶色谱法分离蛋白质时利用了蛋白质相对分子质量大小和形状的不同。 （） 电泳法分离样品只取决于蛋白质的相对分子质量大小。 （） 红细胞的洗涤是为了彻底除去杂蛋白 ，应快速高速离心。 （） 猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核 ，提纯时杂蛋白较少。 （） 样品处理和粗分离的目的都是除去相对分子质量较小的杂质。 （） 若红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。 （） 8.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的依据是蛋白质分子相对分子质量和带电性质的差异。 【合作探究】 主题1蛋白质的分离原理及方