核酸提取常见试剂的作用原理[整理].pdfVIP

异硫氰酸胍 强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级 结构的破坏消失而迅速与核酸分离。胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂，在通常使用的 蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍，它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状 态。含有强力的阴离子和阳离子基团，它们可以形成较强的氢键。在还原剂存在的情况下， 异硫氰酸胍可以断裂氢键，而去垢剂，如 SDS 存在的情况下，可以破坏疏水作用。 盐酸胍、尿素 盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，它并不是一种足够强的变性剂，可以允许完整的 RNA 从富含 RNase 的组织中提取出来。 4-8M 可断裂氢键，有两种可能机制：1 变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合，形成变性 蛋白-变性剂复合物，当复合物被除去，从而引起 N-D 反应平衡向右移动，随着变性剂浓度 增加，天然状态的蛋白不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性；2 盐酸胍、尿素对 氨基酸的增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，结果盐酸胍、尿素 就称为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，盐酸胍、尿 素引起的变性往往是不可逆的。 高浓度尿素使蛋白质变性并抑制 Rnase 活性 十二烷基肌氨酸钠 使蛋白质解体 变性 巯基试剂 1 防止蛋白质或酶等（如辅酶A）分子中SH 基团氧化成二硫键，2 在某些酶反应过程 中维持体系的还原环境。DTT，DDTE、巯基乙醇应用最广，谷胱甘肽也常应用，由于他是生 物体内的还原剂，同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放。DNA 提取中，常使用巯基乙 醇，维持缓冲液的还原环境，防止多酚类氧化，由于具有一定的毒性，浓度不应高于 2%。 巯基乙醇 β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase 蛋白质中的二硫键（肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残 基中的键）。 1 还原蛋白质二硫键，使 Rna 酶变性 2 抑制酚类氧化，若氧化，核酸会变成灰黑色，苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸二 酯键的断裂及导致 RNA 和 DNA 的交联 3 保护蛋白质的巯基 蛋白质提取中需要 巯基乙醇还原二硫键，使 RNA 酶失活 化学变性剂 SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白质变性但不 影响肽键和二硫键，不能使蛋白质彻底变性 加上还原剂巯基乙醇或 DTT，能还原二硫键，使 RNA 彻底变性 DTT 二硫苏糖醇 刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且 DTT 比巯基乙醇的浓度低7 倍时， 两者效果相近，但 DTT 价格略高一些。由于容易被空气氧化，因此 DTT 的稳定性较差；但 冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化的硫的亲核性较低，随 着 pH 值的降低，DTT 的有效还原性也随之降低；DTT 或含有 DTT 的溶液不能进行高压处理。 抑制 Rnase 活性 TCEP 三(2- 甲酰乙基)膦盐酸盐 半胱氨酸 Trizol 苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等。TRIzol 的主要成分是苯酚。苯酚的主 要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白 质，但不能完全抑制RNA 酶活性，因此 TRIzol 中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、 β-巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase （RNA 酶）。 0.1%的 8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构 消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase 蛋白质中的二硫键。 液氮 组织破碎，裂解细胞 SDS 十二烷基硫酸钠 阴离子去垢剂，高温（55-65℃）裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，形成SDS/蛋白质/ 多糖复合物，释放核酸，提高盐（KAc 或 NaAc）浓度并降低温度（冰浴），使SDS/蛋白质/ 复合物转变为溶解度更小的钾盐酸形式，使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全、离心后除去 沉淀，上清液中的 DNA 用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的 DNA 操作简单，温和，可提取到高分子量的 DNA，但产物多糖类杂质较多 阳离子强表面活性剂，通常与蛋白酶 K 和抗氧化剂、螯合剂一起使用 可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与 DNA 分离 溶解膜类蛋白 SDS 能裂解细胞。使细胞中的蛋白质和核酸之间常借着静电引力或配位键结合，阴离子去 污剂能够破坏这种价键，使染色体离析，蛋白变性，释放核酸。 （1）SDS 是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢