(完整word版)乳鼠心肌细胞分离步骤.docxVIP

一、细胞室灭菌 将酒精灯、止血钳、枪、滴管架子、离心管架子、器械饭盒等清点无误后置于超净台内，紫外照射 20-30min 。 （注：物品不可重叠放置，否则会遮挡射线。培养细胞和培养用液不可照射紫外。） 将实验服等摊开置于培养室，打开紫外照射 20-30min 。 紫外照射结束后，打开超净台风机，吹 10min，吹走 O3。 （注：若超净台内物品不全， 向台内拿取物品前， 应先用 75%酒精喷洒消毒。） 二、胶原酶 1 的配置 分离心肌细胞的胶原酶 1 浓度为： 10mg胶原酶 /12ml PBS 。 具体方法为：（以下过程均在超净台内操作） 称取 10mg胶原酶于小烧杯中。 加入 12ml PBS 溶液。 灼烧止血钳，夹出青霉素小瓶，灼烧备用。 用 10ml 一次性无菌注射器吸取小烧杯中溶液， 用一次性无菌滤器过滤于青霉素小瓶中，即得到无菌的胶原酶 1 溶液，呈淡土黄色。 三、取材并分离心肌细胞 用止血钳取 5-6 个平皿，分别加入适量 PBS溶液。 用止血钳夹住小烧杯壁，从器械饭盒中取出剪刀、镊子等器械。 准备 2 个小烧杯，加入 75%酒精适量，一个置于超净台外，一个置于超净台内。 先将乳鼠头朝下置于外面的小烧杯中消毒2min 左右，取出，拿进超净 台内，置于内部的小烧杯中消毒 2min. 左手捏住乳鼠背部皮肤，暴露出胸腔，右手拿一直的小剪刀，在中间靠左处剪开皮肤，左手轻轻一捏，其心脏即弹出来。 剪下心室部分置于含 PBS的平皿中。 待 8 只乳鼠心脏全部取定后，换手套，喷酒精。 左手拿镊子，右手拿剪刀，在心脏中间部位剪一刀，成“肉夹馍”形，在 PBS中冲洗干净，洗去血细胞。 将心室转移到另一新的培养皿中，继续清洗，此时可继续打开心室，取出余血。 继续冲洗 2-3 遍， 将洗好的心脏置于含转子的带盖玻璃瓶中（提前将转子取出置于干净处），加入 2ml PBS 溶液。 灼烧剪刀，左手拿玻璃瓶，右手拿剪刀剪碎心脏成不能再剪的碎片。 用枪吸掉上清，只留碎片，将转子放入玻璃瓶中，盖好盖子备用。 取出 4 个 10ml 玻璃离心管， 各加入 4ml 含血清及 BRDU的 DMEM于其中。 在含心脏碎片的玻璃瓶中加入 2ml 胶原酶 1 溶液。 从超净台中取出玻璃瓶，置于磁力搅拌器上的小圆饭盒中（内含 37°C 热水），37°C消化 5min。 取出，喷酒精，拿回超净台内，吸取上清中已消化好的细胞加入到含血 清和 BRDU的 DMEM的玻璃离心管中，此时加入到离心管中的上清中的胶原酶被稀释而减弱消化反应。 在剩下的细胞碎片中再加入 2ml 胶原酶溶液，重复消化 2 次，每次消化结束后，均需将上清吸到上述离心管中。 第 4 次消化改为 37°C消化 7min，将上清转移到离心管中反复重复消化（共 4 次 37°C， 7min）至不能消化为止。 取含细胞消化液的玻璃离心管，用枪吹打混匀，使酶与 DMEM充分混匀，并进一步分离组织块。 配平后，从超净台中取出， 1000 转离心 5min。 离心结束后，取出离心管，拿回超净台内。 取滴管 1 支，火焰灼烧整个滴管，置于滴管架上放凉备用。 用滴管吸掉离心管中上清培养液以除去胶原酶，若吸不干净，管底允许留少许培养液。 用枪加 4ml 新鲜的含血清和 BRDU的 DMEM于离心管中。 取一只新的滴管，灼烧冷却后，吹打离心管中细胞，至细胞均匀悬浮。为控制吹打后量，吹打次数可固定，如 100 下。吹打时，滴管头部置于溶液底部，防治吹打出气泡。 将 200 目筛网置于灭过菌的烧杯上，用滴管吸取细胞悬液，加到筛网上过滤，以除去未消化的组织块，只让单个细胞过滤到烧杯中。 此时，得到的细胞即为分离好的乳鼠原代心肌细胞及成纤维细胞。 四、分离的心肌细胞的培养 将烧杯中的细胞溶液吸到培养瓶中 /6 孔板 /96 孔板中，做好标记。 若用培养瓶培养，则先将瓶塞拧松半圈，置于孵箱中静置1-2h 。 因为成纤维细胞先贴壁， 1-2h 后，取出孵箱中的培养瓶于超净台中， 竖起培养瓶，用滴管吸取细胞溶液于细口瓶。 吹打均匀后，用细胞计数板计数。 5. 计数技术后，向 6 孔板中种细胞。用枪从细口瓶中吸取细胞溶液，加入到 6 孔板中，摇匀后，补充新鲜的含血清和 BRDU的 DMEM至 2ml 左右，标记后置孵箱中培养。 注：四 1、2 步骤后可显微镜观察培养瓶中的细胞。 五、清理实验用品和台面，并用酒精棉球擦洗超净台台面。 备注：接种细胞密度依实验目的而定 一般而言，进行细胞实验时，应结扎 5×105 密度 / 孔提取蛋白实验时，应接种 5× 106 密度 / 孔。