口蹄疫病毒O与A型交互反应性全牛源单抗的制备及其识别表位鉴定.pdfVIP

摘 要 口蹄疫 （FMD ）是由口蹄疫病毒 （FMDV ）引起的能够侵害猪、牛、羊等偶蹄动物的一种烈 性传染病，对家畜及其相关产品的国际贸易影响巨大。口蹄疫病毒一共分为7 个血清型 （O、A 、 C、Asia 1、SAT 1~3 ），每个血清型中不仅包含多个具有地域特征的拓扑型，每个拓扑型中还可 分为多个谱系。我国O 型FMDV 是目前防控难度最大的病毒血清型，流行状况复杂，出现了3 个拓扑型中4 个谱系病毒共存的状况；而A 型FMDV 是抗原性变异最大的一个血清型。尽管不 同血清型间不能提供交叉免疫保护，但是，有历史研究数据表明，经过O、A 与Asia 1 三种血清 型病毒免疫，可以产生对其它血清型病毒的交叉保护，说明不同血清型间存在保守的抗原结构， 这种保守的抗原结构能否诱导广谱中和抗体的应答，有待进一步研究。 本研究采用3 个不同谱系的O 型FMDV 毒株与1 个谱系的A 型FMDV 毒株间隔一定时间免 疫牛。利用FluoProbes 647H 和Pacific Blue 分别标记FMDV O 型与A 型146S 病毒粒子作为诱饵 抗原，采用流式细胞术从外周血中分离出抗原特异性抗体分泌单个B 细胞，从中获取抗体可变区 基因，构建完整抗体的真核表达质粒，转染Expi 293 F 悬浮培养细胞，进行单克隆抗体的表达与 纯化。通过间接免疫荧光实验 （IFA ）、酶联免疫吸附试验 （ELISA ）、Western-blot （WB ）、病 毒中和试验 （VNT ）来验证抗体的生物学活性。通过本研究，共表达出了56 株全牛源IgG 单克 隆抗体 （mAbs ），经ELISA 和IFA 验证后，42 株为FMDV 特异性mAbs，其中14 株mAbs 为 FMDV O 型与A 型交互反应性抗体，其余28 株mAbs 为FMDV 单特异性抗体。WB 结果显示 42 株mAbs 中有7 株mAbs 可识别O 型与A 型抗原中的线性表位，其余判定为构象性抗原表位。 56 株mAbs 中，有2 1 株FMDV 中和活性mAbs，其中20 株mAbs 均对A/GDMM/CHA/20 13 具有 中和作用，该20 株mAbs 中又有4 株mAbs 同时对A/WH/CHA/09 具有中和作用；2 1 株mAbs 中有3 株mAbs 可中和O 型流行毒株，但只有 1 株 （R50 ）为广谱中和抗体，可以中和FMDV O 型与A 型不同谱系毒株。应用IMGT 数据库对R50 的IGHV （D ）J 和IGLV J 胚系基因进行定位分析， 结果发现R50 不仅含有超长HCDR3，且重链与轻链可变区序列使用牛胚系IGHV 1-7*02 基因片段和 IGLV 1-47*01/ 1-52*01 基因片段。 综上所述，本研究采用两种不同荧光标记的O 型与A 型146S 抗原，利用单个B 细胞抗体技 术，筛选出了14 株FMDV O 型与A 型交互反应性抗体，其中有1 株为O 型与A 型广谱中和抗 体，为解析型间保守的抗原结构奠定了基础。 关键词：口蹄疫病毒，牛，单个B 细胞抗体技术，交互反应性抗体 III Abstract Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagious animal disease caused by foot-and-mouth disease virus, which mainly affects cloven-hoofed animals, such as cattle, sheep and pigs, and has a significant impact on international trade related to livestock and their products. There are seven serotypes of foot-and-mouth disease virus (O, A, C, Asia 1, SAT 1 ~ 3). Each serotype contains multiple topotypes with geographical characteristics, and eac