抗犬细小病毒基因工程抗体的制备及初步应用.pdfVIP

摘 要 犬细小病毒疾病是由细小病毒科成员犬细小病毒 （CPV ）感染引起的，是一种高危险性、高 接触性、呈急性发病的烈性传染病。该病传染性强和死亡率高的特点给我国犬类及宠物饲养业造 成了极大的经济损失和影响。目前应用于临床治疗的抗犬细小病毒单克隆抗体都是鼠源的，应用 于犬体治疗时存在被免疫系统识别产生犬抗鼠抗体，很快被清除等问题；另一方面，单克隆抗体 基因容易在较长的传代过程中丢失，且在真核细胞中获得抗体的方法成本很高。因此，近年来单 链抗体（scFv ）由于其免疫原性弱，相较简单和低成本的制备工艺而发展为目前研究最多的基因 工程抗体之一。 为了获得成本低且具有治疗效果的scFv，减小犬细小病毒病的临床治疗压力，本研究旨在利 用大肠杆菌表达系统制备抗CPV 的scFv，检测其生物活性并进行初步应用。方法为以实验室前 期制备获得的，可以分泌具有中和活性的抗CPV VP2 蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株为基础，提 取该杂交瘤细胞的总 RNA ，反转录合成cDNA 链，以此为模板扩增并获得了抗体的重链可变区 （VH ）基因和轻链可变区（VL ）基因；将可变区基因连接至原核表达载体pOPE101 ，成功构建 重组质粒 pOPE-scFv；测序结果与抗体基因数据库比对，获得了抗体可变区序列，VH 基因大小 为387bp ，VL 基因大小为393bp 。重组质粒转化XL1-blue 感受态细胞经IPTG 诱导表达，经SD S和Western blot 验证分析蛋白大小约为 35ku ，与预期结果相符。为了提高 scFv 的表达 量，构建了同时表达抗体可变区基因、Erv1 基因以及DsbC 基因的重组质粒pET23b-GB，经转化 Rosetta 感受态细胞诱导表达，SDS和Western blot 结果表明scFv 表达量得到明显提高且 可以被抗His 标签抗体识别。利用His 标签树脂亲和层析纯化scFv 浓度为 1.120mg/mL ；经酶联 免疫吸附试验 （ELISA ）结果表明原核表达的 scFv 可与VP2 蛋白抗原结合活性；经间接免疫荧 光实验表明scFv 可与CPV 和FPV 特异性结合；经微量细胞中和实验证明scFv 保留了中和CPV 和FPV 的活性，对CPV 的中和效价为1:40 （0.028mg/mL ），对FPV 中和效价为1:20 （0.056mg /mL ）。建立感染CPV 动物模型，发病犬在连续注射scFv 3 天后恢复健康，证明原核表达的scF v 可以对感染CPV 的犬产生治疗保护效果。 本研究获得了抗CPV VP2 蛋白抗体的可变区序列，在实现原核表达的基础上提升了其表达 量，经以上研究结果表明本研究制备的scFv 具有治疗犬细小病毒病的应用前景。 关键词：犬细小病毒，单链抗体，原核表达，中和活性，临床治疗 I Abstract Canine parvovirus disease is caused by infection with canine parvovirus (CPV), a member of the Parvoviridae. It is a high-risk, high-contact, acute-onset severe infectious disease. The hig h infectivity and high mortality of the disease have caused great ec onomic losses and impacts on the canine and pet breeding industry in our country. At present, anti-canine parvovirus mono clonal antibodies used in clinical treatm