尿路致病性大肠杆菌溶血素调控因子鉴定及毒力致弱研究.pdfVIP

摘 要 尿路致病性大肠杆菌（Uropathogenic Escherichia Coli, UPEC ）作为肠道外致病性大肠杆菌的 一种，可导致膀胱炎、肾盂肾炎及溶血性尿毒症的发生，据统计，约有80%尿路感染由尿路致病 性大肠杆菌引起，而在女性当中发病尤为普遍。国内外已有学者对其致病性的分子机制加以深入 研究，作为典型的肠道外致病性大肠杆菌，除具备典型的黏附与侵入功能外，UPEC 还产生一些 毒素成分，如I 型细胞坏死因子、α-溶血素、Chu 等。 溶血素是尿路致病性大肠杆菌重要的毒力因子之一，以其具备裂解红细胞的能力而得名。作 为一种成孔毒素，近些年已有部分学者对大肠杆菌溶血素的表现型加以研究，发现其不仅具有裂 解细胞的作用，还可通过激活细胞内典型炎症小体进而促进细胞焦亡。但是，溶血素蛋白的表达 调控尚不清楚。 本实验通过转座子插入失活的方法在无氧培养条件下筛选出影响尿路致病性大肠杆菌 CFT073 菌株溶血活性的基因位点，共筛选到包含溶血素操纵子在内的14 个转座子插入位点，其 中包括钼辅因子 （moco ）合成相关基因mobA、moeB 、mogA ，全局调控因子fnr ，膜转运蛋白tatB 及Fe-S 簇合成伴侣蛋白hscA 等。 我们针对筛选出的钼辅因子合成相关基因进行深入研究，证明其对无氧条件下溶血素表达的 影响。通过转录组测序分析，我们证实 Moco 通过溶血素操纵子上游与其共转录的 c3566-67-68 基因进而在转录水平上影响溶血素操纵子hlyCABD 的表达。此外，我们也证实了Moco 对溶血素 表达的影响调节了尿路上皮细胞的死亡，并且在小鼠尿路感染模型中，Moco 相关基因缺失影响 了UPEC 对尿路的定殖。 为深入研究Moco 相关基因影响c3566-67-68 基因及溶血素操纵子hlyCABD 表达的机制，我 们在mobA 缺失株中构建转座子随机突变库，通过对抑制子（Suppressor mutation）的筛选找出使 mobA 缺失株溶血活性增强的突变株。在我们筛选到的8 个使mobA 缺失株溶血活性增强的转座 子插入基因位点中有4 个基因在功能或位置上与氮代谢调控因子NtrC 有关，我们也证实了无氧 条件下mobA 的缺失激活了氮代谢调控因子NtrC ，进而通过溶血素上游c3566-67-68 基因抑制溶 血素操纵子hlyCABD 的表达。 此外，我们也发现在无氧条件下，fnr 、tatB、hscA 等基因均通过c3566-67-68 基因簇影响溶 血素操纵子的表达，揭示了c3566-67-68 基因簇可能作为溶血素调控的一个重要中枢，具有十分 重要的研究意义，并且有一定的疫苗研发潜力，也为防控肠道外致病性大肠杆菌病提供借鉴。 关键词：溶血素，尿路致病性大肠杆菌，转座子突变，调控，钼辅因子 I Abstract As one of the Extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) pathotypes, uropathogenic E. coli (UPEC) can cause cystitis, pyelonephritis and hemolytic uremic syndrome. It has been estimated that about 80% of urinary tract infections are caused by UPEC, which is particularly common in women. As a typical ExPEC pathotype, the molecular pathogenesis has been well studied by domestic and foreign scholars. In addition to its typical adhesion and invasion functions, UPEC also produces some toxins, such as CNF1, HlyA and Chu. Hemolysin (HlyA) is one of the important virulence fac