活性小分子多肽的筛选与表达.pdfVIP

目 录 摘 要i Abstract iii 第一章 综述1 1.1 酸敏感离子通道的研究概况和意义1 1.1.1 酸敏感离子通道的结构1 1.1.2 酸敏感离子通道的功能3 1.1.3 酸敏感离子通道的调控因子8 1.2 蜘蛛毒素的研究概况和意义13 1.2.1 蜘蛛毒素的组成14 1.2.2 蜘蛛毒素的应用19 1.3 酵母双杂交系统的研究概况和应用范围23 1.3.1 酵母双杂交系统的基本原理24 1.3.2 酵母双杂交系统的优点25 1.3.3 酵母双杂交系统的应用26 1.3.4 酵母双杂交系统的局限性及其衍生系统29 1.4 本课题的研究内容和意义31 第二章 随机五肽文库的构建33 2.1 前 言33 2.2 材料与方法35 2.2.1 实验材料和试验设备35 2.2.2 实验方法36 2.3 实验结果及分析46 2.3.1 酵母双杂交系统质粒pGADT7-PcTx 1 的构建46 第 I 页 2.3.2 电转化的转化率以及文库库容量的计算47 2.3.3 随机五肽文库复杂度的分析47 2.4 讨论49 第三章 随机五肽文库与rASIC1a 膜外区的筛选50 3.1 前言50 3.2 材料与方法50 3.2.1 实验材料和试验设备50 3.2.2 实验方法51 3.3 实验结果与分析56 3.3.1 转化率及转进酵母的文库数56 3.3.1 酵母双杂交筛选过程中阳性结果的氨基酸序列分析56 3.3.2 酵母双杂交筛选的阳性结果的重复实验及自激活检测58 3.4 讨论59 第四章 筛选阳性结果的表达61 4.1 前言61 4.2 材料与方法62 4.2.1 实验材料和试验设备62 4.2.2 实验方法63 4.3 实验结果与分析72 4.3.1 表达质粒的构建72 4.3.2 融合蛋白的自动诱导表达与亲和层析纯化74 4.3.3 反相高效液相纯化以及质谱鉴定75 4.3.4 目的蛋白纯品的富集和生理活性检测80 4.2 讨论81 第五章 结论与展望84 5.1 实验的主要结论84 第 II 页 5.2 进一步研究展望84 致 谢86 参考文献87 作者在学期间取得的学术成果112 缩略词113 附录1 从动物毒液中分离的ASIC 调节剂的活性总结表114 附录2 rASIC1a 胞外区氨基酸编码序列115 附录3 拟表达的5 个质粒所对应的氨基酸及编码序列116 附录4 实验中常用试剂及培养基配方117 附录5 Ulp1 表达方法120 第 III 页