细胞分裂指数测定及曲线绘制.docVIP

细胞分裂指数测定 实验原理： 体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。 分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。 实验材料： 细胞传代用品，培养细胞常用染色用品。18x18mm2盖玻片，95%乙醇. Gimsa染色液（称取Giemsa粉末0.5g,加入几滴甘油研磨，再加入甘油，加入的甘油总量为33ml,56℃中保温90-120min,然后加入33ml甲醇，置入到棕色瓶中保存，即为Gimsa原液，使用时一般用PBS稀释10倍）。 姬姆萨染色液：配方（姬姆萨氏染料0.60g,甘油50ml,无水乙醇50ml） 配制：称取姬姆萨氏染料粉末0.6g,加入预热至60℃甘油50ml,置入到55-60℃的水浴中，1.5-2h后，加入 使用：方法一：临染色前，在每毫升蒸馏水中加入上述原液1滴，即成姬姆萨染色液，注意，所用的蒸馏水必须是中性或者微碱性，如果偏酸用1%碳酸钾调整. 方法二：在5ml新煮过的中性蒸馏水中滴加5-10滴姬姆萨染色原液，即稀释成常用的姬姆萨氏染色液。摸片经过甲醇固定干燥后，在其上滴加足量染色液或将摸片浸入到盛满染色液的染缸中，染色30min,或者染色数小时至24h,取出水洗，吸干或烘干，镜检，细菌呈蓝青色，组织细胞胞浆呈红色，细胞核呈蓝色。（来自：兽医微生物学实验指导） 实验步骤： 用0.25%胰蛋白酶消化第3代细胞，以1x104接种到铺有盖玻片的6孔培养板中，37℃ 每隔24h取出观察一次，用PBS洗3遍后，用95%乙醇固定10min（甲醇：冰醋酸=3：1固定30min）. 然后用Giemsa液染色10min（5微克/mlDAPI染色10min） 用自来水或PBS冲洗。 待盖玻片晾干后反扣在载玻片上镜检（或者盖在滴有甘油的载玻片上，封片后在荧光显微镜下观察）。 细胞计数：选择细胞密度适中区域观察分裂细胞，进行细胞计数，最好一个视野一个视野进行，对每一时间组的玻片各取细胞数多，中，少3个区域各一区，共数1000个细胞，计算出每1000个细胞中的分裂相平均数值和所占百分比（或者同倍镜下取5个不同视野，计数分裂相细胞，取平均值，连续7天，以时间（天）为横坐标，细胞分裂相的千分率为纵坐标，绘制分裂指数曲线图。 5,分裂前期，6分裂中期，7，分裂后期，8分裂末期 2012-4-1成年猪MSCs分裂后期及末期hoechest标记 2012-4-1成年猪MSCs分裂中期及后期 hoechest标记 2012-4-1成年猪MSCs分裂前期hoechest标记 2012-4-2成年猪MSCs 培养F2 53h的核分裂相，分裂后期。Giemsa染色 2012-4-2成年猪MSCs 培养F2 53h的核分裂相，分裂末期。Giemsa染色 2012-4-2成年猪MSCs培养的F2 26h细胞状态，分裂前期 Giemsa染色 实验误差分析： 接种时按照检测细胞生长曲线的细胞接种原则将悬液接种到事先放置有小盖玻片的培养瓶内。 细胞分裂指数的观测要掌握好标准，对接近和将完成的分裂相要统一标准加以划分，减少误差。 来自：2008刘忠华猪骨髓间充质干细胞分离培养及其移植胚胎发育潜能的研究