外周血染色体标本的制备法.docx

附件一 外周血染色体标本的制备法 该法是制备各种染色体标本的基础。 一、操作过程： 1、采血：先在采血者肘部用碘酒棉球及酒精棉球消毒皮肤，再取 2 毫升干燥灭菌 注射器，配上针头（6?7号），并吸取0.2%的肝素液（Heparin ） 0.2毫升，湿润针筒。 再从肘部静脉采血 0.7?1毫升，轻轻转动针筒，使之与肝素混匀。 2、培养：拔去抽血用针头，立即插入灭菌试管内，送入无菌操作箱（此时操作者 必须用肥皂洗刷双手， 并用自来水冲洗干净， 然后双手进入无菌操作箱， 依次用碘酒及 酒精棉球消毒双手，在火焰旁将血液平均滴入 2? 3 个已盛好培养基的小瓶内（培养基 的组合： RPMI1640 或 Eagle 或 M199 毫升，小牛血清 1 毫升， PHA5 毫克，用 5%NaHC3O 调pH至7.0?7.4 ）,盖上翻口瓶盖，轻轻摇动。如到外地采血培养亦可因地制宜，无 需在无菌操作箱内接种， 方法是： 抽血完毕， 转动针筒， 将血液与肝素混匀， 拔去针头， 重新换上灭菌注射针头， 将血液直接从翻口橡皮塞 （用碘酒及酒精棉班干部消毒） 上插 入，将血液缓缓滴入培养瓶内，轻轻摇动，置 370C温箱中培养66?72小时。 秋水仙素（ Colchieine ）处理：在终止培养前 4?6 小时，将事先配制好的 0.01% 秋水仙素1滴（每毫升50滴约2卩g）加入培养瓶内，轻轻摇动，放回温箱中，继续培 养 4?6 小时，这样使细胞分裂停止在中期。 4、 离心：用吸管吸取培养物，并移入刻度离心管内，以 1000 转/分离心 8分钟， 吸去上清液，留底层离心沉淀物。 5、 低渗处理：加 5毫升预温（370C）的0.75M KCI低渗液，用吸管打匀使细胞悬 浮于低渗液中，仍放回 370C温箱中，静止15分钟。这样使白细胞膨胀，染色体分散， 红细胞解体。 6、 预固定：在低渗 15分钟后，加固定剂（冰醋酸 :甲醇， 1:3） 1 毫升，打匀。 7、 再离心：为了收集细胞，以 1000转/ 分离心 8分钟，然后吸去上层液，保留沉 淀物。 8、 固定：沿离心管管壁加入新配制固定液（甲醇 :冰醋酸， 3:1 ） 5毫升，过 5 分 钟后，用吸管将底部沉淀物轻轻打匀，继续固定 30分钟。 9、 再离心：以 1000转/分离心 8分钟，弃去上清液。 10、 再固定：再加入新配固定液 5 毫升，打匀，静止 30分钟。 11、 再离心：以 1000 转/分离心 8分钟，弃去上清液。 12、 四次固定：加入新配固定液 0.5?1 毫升，打匀制成细胞悬液。 13、 制片：用滴管吸细胞悬液 2?3滴，滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即 用口吹散， 并在酒精灯的火焰下通过几次， 促使细胞平铺于载玻片上， 并在空气中晾干 或用电吹风吹干。 14、 染色：用Giemsa染液染色30分钟（取Giemsa原液1份，pH7.4的磷酸9份）， 然后取出玻片，用蒸馏水轻轻冲洗，并晾干。 15、 镜检及摄影：将染色后的玻片先用低倍镜作全面检查，寻到良好的分裂相后， 换用高倍镜和油镜进行观察， 进行研究分析， 必要时选择几个分裂相好的标本， 进行显 微镜摄影，冲洗放大。 16、核型分析：将放大后的照片上的染色体一一剪下，将大小相同的，成对的排 在一起(按丹佛体制) ，计数并分辨各个染色体的形态，注意有否异常。根据这些特点， 做出正确的分析判断，然后写出报告。 二、注意事项： 1、外周染色体标本制备失败最常见的原因 : ( 1)器皿洗涤不净、有酸碱残留。 (2)培养液太酸或太碱均不利细胞生长，可用 5%MaHCO或0.2%的HCL调节pH至 7.2?7.4左右。 ( 3)种人细胞数太多或太少。 ( 4)无菌操作不严，严重污染。 ( 5) PHA 是成败的关键，如果保存不善，效价低或数量不足，则作用差，但浓度 过大红细胞凝块，这些都会影响细胞生长。 ( 6)培养细胞的温度严格掌握在 37±50C。 ( 7)药品称量要十分准确，否则造成渗压高或低。 2、标本质量不佳的最常见原因 : ( 1)秋水仙素一次配制后冰冻保存不超过半年，用量过大，染色体过度收缩，乃 至染色体离散，用量小则影响分裂相。 ( 2)低渗处理极为重要， 低渗不够则染色体团在一起， 太过则往往细胞全部破碎， 染色体丢失不全。 ( 3)细胞太多或太少均会影响分裂相的多少及标本质量。 ( 4)离心速度太高，细胞团块不易打散，速度太低则会丢失大量分裂相。 ( 5)机械打散无力，细胞成团，若用力过猛，细胞容易破碎，染色体不完整。 ( 6)固定液加入太快，混匀太快，会使固定作用过强，染色体扭转，固定液作用 不足， 染色体出与毛刷状， 因此固定液纯度要高， 临时用新鲜配制， 应沿管壁慢慢加入， 固定后彻底打匀。 ( 7)玻片应严格清洁，去