生物制药与药品检验技术 动手做：猪血清蛋白的分级盐析制备 课件：猪血清蛋白的分级盐析制备操作.pptx

;项目一 血清蛋白类药物的原料制备与分析检验;实训 猪血中血清蛋白的提取;一、实训目的;二、实训意义;三、实训准备;试剂： 1. 饱和硫酸铵溶液 等电点促进蛋白质沉淀，选择4.5（白蛋白）和7.4（IgG）两个pＨ值进行盐析。 （1）饱和硫酸铵（SAS）Ａ（1L）：量取 500ml 水，加热至80℃。称取硫酸铵 400g 溶于水中，搅拌 20min，冷却后上清即为饱和硫酸铵。再取28％ 氨水调 pH值至 7.4。 （2）饱和硫酸铵（SAS）B （1L） ：取0.5mol/L H2SO4 调 pH值至 4.5。;2. 缓冲液 （1）缓冲液Ａ（500mL）：称取NaCl 76.5g、柠檬酸·H2O 1.92g、Na2HPO4·12 H2O 32.54g，溶于水，调pH值为7.4，定容于1000ml。 （2）缓冲液B （500mL） ：称取NaCl 76.5g、柠檬酸·H2O11.52g、Na2HPO4·12 H2O 16.18g，溶于水，调pH值为4.5，定容于1000ml。 3. 其他溶液 0.85% NaCl 溶液 （2L）;思考题： 1、为什么在血清中加入硫酸铵，蛋白质就沉淀了？ 2、为何选取这2个pH值（4.5，7.4）（pH value）进行盐析？ 3、缓冲液（buffer solution）的作用？ 4、式（1） 5 mL缓冲液＋10S×5 mL SAS＋（8－10S）×5 mL水 理解了吗？ 5、冰箱静置过夜目的？ 6、为何用不同饱和度的硫酸铵进行盐析？ 饱和度—盐浓度（concentration）;四、实训步骤;步骤一：猪血清准备 取新鲜采集的猪血，离心（centrifuge），取上层血清（upper serum）。 ;步骤二：分级盐析提取猪血清蛋白 按照式（1）配制底液，混匀后加入5 mL血清，轻轻振荡混匀，4℃冷藏过夜。 5 mL缓冲液＋10S×5 mL SAS＋（8－10S）×5 mL水（１） S为硫酸铵饱和度。样品为10倍稀释血清样品。 在pH7.4或pH4.5条件下进行分级盐析。 注意观察：硫酸铵饱和度增加，沉淀增多了？（如图）;步骤三：离心（centrifuge ）（至少24h后） 取15 mL样品（sample）离心10 min，转速4000r/min。 沉淀溶于25 mL 0.85% NaCl 溶液（solution）中（50 mL容量瓶）。 上清液（supernatant）弃去。 ;步骤四： 脱盐（desalination） 目的：除去硫酸铵等 不是必须的步骤;步骤五：冰箱保存样品，供下次使用。 ;五、注意事项;六、安全提示;七、实训小结