金属离子螯合层析演示幻灯片.pptVIP

1 金属离子亲和层析的应用 2 目录 一、亲和层析 二、金属离子亲和层析 三 、金属离子亲和层析的应用 四 、金属离子亲和层析的局限 3 一、亲和层析 亲和层析是利用配基、配体之间专一可逆 结合性质进行物质分离的方法 , 因此其专一性、 选择性是极高的 。 4 5 6 亲和层析的过程 1 、寻找可与底物专一可逆结合的配基 2 、将配基通过共价键偶联到基质，并要求偶 联后配基与配体的亲和力不变 3 、配基与配体吸附并与杂质分离，将杂质洗 出 4 、洗脱目标物 7 亲和层析的分类 1 、生物亲和层析 2 、免疫亲和层析 3 、金属离子亲和层析 4 、有机染料亲和层析 5 、拟生物亲和层析 8 二、金属离子亲和层析（ IMAC ） 金属离子亲和层析是建立在 蛋白质表面暴 露的 一些 氨基酸残基 与 固定化金属离子 的亲 和力的不同来进行蛋白质分离纯化的一项技 术 金属离子：锌、铜、铁等 氨基酸残基：组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的 巯基、色氨酸的吲哚基 9 金属离子亲和层析优点 1 、配基简单，吸附容量大 2 、价格便宜，投资低 3 、通用性强 4 、分离条件温和 5 、金属离子配基具有很好的稳定性，且层析柱可 长期连续使用，易于再生。 10 三、金属离子 亲和层析的应用 纯泰 Ni- NTA 金属螯 合 His 蛋白纯 化介质填料 （ His 镍柱） 11 （一）、用于分离纯化变性蛋白 金属离子亲和层析复性中， 蛋白质 能可逆吸附在固相介质上 ，可避免伸展的多 肽分子之间形成聚集体。在高浓度变性剂存 在的情况下，组氨酸尾仍旧具有吸附在金属 离子亲和层析介质上的能力，所以可在 IMAC 介质上同时实现复性与纯化。蛋白质 吸附在 IMAC 介质上后，先逐步降低变性剂 的浓度，使蛋白质折叠，然后提高咪唑浓度 把折叠后的蛋白质洗脱出来。对于 TNF 蛋白， 使用 IMAC 可获得 90 ％的复性收率。 12 （二）、用于蛋白质分析鉴定 1 、 1 ）科学家通过 金属离子亲和层析 对糖基化 导致 α 一胰凝乳蛋白酶结构变化进行了研究， 证明糖基化作用产生两个截然不同的蛋白质， 他们对金属离子的亲和性完全相反。 2 ） 蛋白质的磷酸化和去磷酸化是生命体 代谢调控的重要机制，已发现 IMAC 能鉴定 磷酸化的蛋白，其中 Fe 3 -IMAC 已被用来选 择性纯化和浓缩磷酸化的蛋白和多肽。 13 2 、 IMAC 与重组技术相结合可以使 带六聚组氨 酸的蛋白质 固定在基质上，从而为研究蛋白 质的相互作用开辟了新的途径。 例： Celia 等用 Ni 2 + 负载的金属螯合脂质定向 膜捕获组氨酸 MHC 分子，再通过表面等离 子体共振技术考察它们对 T 细胞受体的结合。 14 （三）、用于提取目的蛋白 在基因重组过程中加入聚组氨酸六肽作为 亲和标识物来分离纯化目的蛋白 15 （四）、用于核苷酸的纯化 IMAC 也可以应用于核苷酸的纯化，比如用 组氨酸标记的 PCR 产品，单链、双链核苷酸 及嘌呤等 例：从质粒 DNA 产物中除去被损坏的染色体 DNA