实验一cb法提取植物基因组dna.docx

实验C T A B 法 提 取 植 物 基 因 组 D N A 实验 实验目的： 学习从植物组织中（幼叶）提取基因组 DNA勺基本原理和方法。 实验原理： 采用机械研磨勺方法破碎植物勺组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤 其是氧化酶类），其对DNA勺抽提产生不利的影响，所以在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂 或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类勺活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并 减少研磨过程中各种酶类勺作用。 CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化铵 ） ，是一种阳离 子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐的溶液中（＞L NaCI）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多 糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀（CTABE溶于乙醇）即可使核酸分离出来。 CTA溶液在低于15度时会形成沉淀洗出，因此再将其加入冰冷的植物材料中之前必 须预热（ 65度），且离心温度不要低于 15度。 实验步骤： 1、 取幼嫩的植物叶片（3-5g ）剪碎液氮研磨成粉，转入离心管内。加入等体积的65C 预热的DNAM取缓冲液置于65T的恒温水浴摇床上1-2h。 2、 加入等体积的氯仿：异戊醇 （24：1），轻轻上下颠倒 5分钟，静置 5分钟，之后于 12000rpm离心10分钟。 3、 吸取上层水相，重复步骤 2一次。 4、 吸取上层水相，加入预冷 2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒 2分钟并置-20 °C冰箱内 10min,待DN航淀后于12000rpm离心收集，收集的DNAF70汇醇中洗2-3次。将弃去乙醇 风干后的DNA卩适量水使其溶解。 5、 待DNAn全溶解后加入1-2卩I不含RNAaseA（ 10mg/ml），37C保温1h以除去DN肿 的 RNA。 6、 于Eppendof管中加入1m氯仿：异戊醇（24: 1）轻轻上下颠倒10分钟后10000rpm 离心 10分钟。 7、 吸取上层水相并先后加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍总体积的预冷的无水乙醇， 接着置于-20 C冰箱，10分钟后10000rpm离心10分钟，弃去无水乙醇，加入70%乙醇洗涤 2-3次，风干，最后将DNA溶于适量(200-500卩I ) TE中。 8、待DNA完全溶解后进行1%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA勺质量并据已知的DNA分子量 标准估计其浓度。调整浓度后的DNA置于-20 C备用。 实验试剂： 1、 1M Tris-HCL () Tris溶于800ml无菌水中，加浓HC调pH到，定容至1L,高压灭菌。 2、 EDTA() EDTA-Na- 2HO容于800ml无菌水中，需用磁力搅拌器剧烈搅动，用NaO调pH值到(约 20g)，定容至1L，高压灭菌。 3、 NaCL NaCL溶于1L无菌水中，高压灭菌。 4、 10% CTA溶液 10gCTA溶于80ml无菌水中，定容至100mL高压灭菌。 5、DNA提取液 NaCL 200ml (500ml) Tris-HCL 50ml 6、氯仿-异戊醇 EDTA 50ml (24:1体积比) 10%3TAB 100ml 7、RNAaseA Water 100ml 8、异丙醇 9、 无水乙醇 10、 3M醋酸钠 11、 1X TE缓冲液 实验仪器： 液氮罐、离心管、离心管架、恒温水浴摇床、枪及枪头(1ml和200ul)、离心机(转 速可调至4000rpm和10000rpm)、剪刀 注意事项 叶片磨得越细越好。 移液器的使用。 由于植物细胞中含有大量的 DNA酶，因此，除在抽提液中加入 EDTAW制酶的活性 外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出 DNA酶，使DNA降解。