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实验 1 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶 【实验目的】 掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理和校准曲线的绘制。 熟悉丙氨 酸氨基转移酶测定的临床应用。了解固定时间法测定酶活性的特点与应用。 【原理】 丙氨酸氨基转移酶（ala nine ami notran sferase ALT , EC 2 6 12）催化 L-丙 氨酸与a酮戊二酸间的氨基移换反应，生成 a丙酮酸和L-谷氨酸。经30min反 应后，加入2,4-二硝基苯肼终止反应，并与反应液中的两种a-酮酸生成相应的2,4- 二硝基苯腙（丙酮酸苯腙和 a■酮戊二酸苯腙）。在碱性条件下，两种苯腙的吸收 光谱曲线有差别，在 500nm~520nm 处差异最大，以等摩尔浓度计算，丙酮酸苯 腙的呈色强度约为a■酮戊二酸苯腙的3倍。据此可以计算出丙酮酸的生成量。 L 丙氨酸 酮戊二酸 ALT 丙酮酸 L 谷氨酸 酮酸 2，4 二硝基苯肼 碱性条件 2，4 二硝基苯腙 （红棕色，入=505nrj） 【试剂与器材】 0.1mol/L磷酸二氢钾溶液 称取KH2PO4 13.61g,溶解于蒸馏水中，加水 至 1 000ml，4C保存。 0.1mol/L磷酸氢二钠溶液 称取Na2HPO414.22g,溶解于蒸馏水中，并 稀释至1 000ml，4C保存。 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH7.4） 取 0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液 420ml 和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml，混匀，即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿 数滴，4C保存。 基质缓冲液（200mmol/L丙氨酸/2.0mmol/L -酮戊二酸） 精确称取DL- 丙氨酸1.79g, a-酮戊二酸29.2mg,溶于0.1mol/L磷酸盐缓冲液约50ml中，用 1mol/L NaOH调pH至7.4,再加磷酸盐缓冲液至100ml, 4C?6C保存，该溶 液可稳定2周。每升底物缓冲液中可加入麝香草酚 0.9g或加氯仿防腐，4°C保存。 1.0mmol/L 2,4-硝基苯肼溶液 称取2,4-二硝基苯肼（AR） 19.8mg,溶于 1.0mol/L盐酸100ml，置棕色玻璃瓶中，室温中保存。若有结晶析出，应重新配 制。 0.4mol/L NaOH溶液 称取NaOH 1.6g溶解于蒸馏水中，并加蒸馏水至 100ml，置具塞塑料试剂瓶内，室温中可长期稳定。 2.0mmol/L丙酮酸标准液 准确称取丙酮酸钠(AR) 22.0mg,置于100ml 容量瓶中，加0.05mol/L硫酸至刻度。丙酮酸不稳定，开封后易变质，相互聚合 为多聚丙酮酸，需干燥后使用。 【操作步骤】 ALT校准曲线绘制 (1)按表3-17向各管加入相应试剂。 表3-17 ALT校准曲线绘制 加入物(ml) 1 2 3 4 5 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 2.0mmol/L丙酮酸标准液 0 0.05 0.10 0.15 0.20 基质缓冲液 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 2,4-二硝基苯肼溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，37C水浴20min 0.4mol/LNaOH 溶液 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 相当于酶活性浓度(卡门氏单位) 0 28 57 97 150 (2)混匀，放置5min,在波长505nm处，以蒸馏水调零，读取各管吸光 度，各管吸光度均减“1”号管吸光度为该校准管的吸光度值。 (3)以吸光度值为纵坐标，对应的酶卡门氏活性单位为横坐标作图，以平 滑曲线表示即成校准曲线。 标本的测定 (1)在测定前取适量的底物溶液和待测血清，37C水浴预温5min后使用; 具体操作按表3-18进行。 表3-18赖氏法测定ALT操作步骤 加入物(ml) 对照管 测定管 混匀后，置37C保温30min 2,4二硝基苯肼溶液 0.5 0.5 基质缓冲液 0.5 一 混匀后，置 37C保温 20min 0.4mol/L NaOH 溶液 5.0 5.0 (2)室温放置5min,在波长505nm处以蒸馏水调零，读取各管吸光度。 【计算】 测定管吸光度减去样本对照管吸光度的差值为标本的吸光度。 该值在校准曲线上查得 ALT的卡门氏单位。 【参考范围】 5卡门氏单位?25卡门氏单位。 【临床意义】 ALT在肝细胞中含量较多，且主要存在于肝细胞的可溶性部分。当肝脏受损 时，此酶可释放入血，致血中该酶活性浓度增加。 1. ALT是肝细胞损伤的灵敏指标。急性病毒性肝炎转氨酶阳性率为 80%? 100%，肝炎恢复期，转氨酶转入正常。但如在100U左右波动或再度上升为慢性 活动性肝炎。重症肝炎或亚急性肝坏死时，再度上升的转氨酶在症状恶化的同时， 酶活性反而降低，提示肝细胞坏死后增生不良、预后不佳。 ?慢