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上述三方面的研究均取得了不同程度的研究结果，但由于当时技术条件的限制都未能全面阐明与白内障相关的基因及其功能。 寻找白内障时晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因有可能揭示白内障的发病机理。 最新.课件 * 寻找差异表达基因的经典方法是消减杂交技术（subtractive hybridization, SH），它是……，但是实验操作复杂。 经过改进后的抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization ,SSH是Diatchenko等1996年建立的方法）……简化了实验操作，但仍然问题很多。 我校生化教研室建立了改良消减杂交技术[19，20]，其特点是：简便易行，能够获得目的细胞特异表达的全长基因，对低丰度基因也能有效分离。 最新.课件 * 该方法的建立者已利用这一技术从脂多糖刺激前后的人牙髓细胞的差异表达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异表达的基因，其中5个为新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地获得白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因，并克隆到全长cDNA，为进一步的结构和功能研究打下基础。 最新.课件 * 基因芯片技术的出现，使检测差异表达基因和未知DNA分子变得更快捷、准确、高效。基因芯片是在1996年被提出并开始研制的，该技术是将成千上万的DNA探针集中到1厘米见方的基片上，利用碱基互补原理，DNA探针中的已知碱基序列与被测定的未知DNA分子杂交后由标记分子标记杂交体，经自动阅读设备分析杂交结果，从而对检测基因进行定性、定量和结构分析，确定未知DNA分子。 最新.课件 * 由于目前尚没有针对白内障研究的现成基因芯片，根据本研究的需要，我们将筛选到的差异表达的所有基因建立cDNA文库，再利用基因芯片技术制备成基因芯片，以此检测多个样本中白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因，从中进一步筛选出白内障特异的基因，它们中可能有已知基因，也可能有未知基因。通过以上两种技术的有机结合，我们能更快捷、有效、准确地得到白内障相关基因。 最新.课件 * 综上所述，分子生物学技术的发展为研究白内障发生过程中的功能基因及特异调控基因提供了有利武器。本项目从晶状体上皮细胞入手，利用改良的消减杂交技术和基因芯片技术系统研究与白内障相关的基因，并采用对体外培养细胞和在体晶状体上皮细胞的基因转染，探讨它们在晶状体上皮细胞变化和白内障形成中的作用，可望阐明白内障晶状体上皮细胞变化的分子生物学机制，为防治白内障提供新的思路和理论依据。 最新.课件 * 3、参考文献 A、文献类别要全：以英文文献为主，同时也要引用  中文文献--- 国内同行中知名专家的文献。 B、引文信息要全：文章题目、作者姓名、具体出处 （包括期刊名、年份、卷期、页码等）。 C、文献年代要新：主要是近五年的文献，最好能有 07年的最新文献。 最新.课件 * 三、研究方案 1、研究目标 撰写要求： 有限目标，与研究内容相呼应 如：明确……关系，揭示……规律， 阐明……原理（机制），建立……方法等 举例：筛选出与老年性白内障相关的基因，明确部分基因在白内障形成中的作用，从晶状体上皮变化的角度阐明白内障的发生机理，为防治白内障提供线索。 最新.课件 * 2、研究内容： 存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成 内容分散，不能集中阐明研究目标 撰写要求：内容要适当—确保研究周期内完成 为目标服务—与目标相辅相成 要重点阐述—注意与技术路线区别 最新.课件 * 举例： （1）筛选白内障相关基因：采用改良的消减杂交技术，获得人老年性白内障晶状体上皮细胞和正常晶状体上皮细胞差异表达的基因片段，建立cDNA文库。制备差异表达基因的基因芯片，利用基因芯片技术从多个标本的老年性白内障晶状体上皮细胞中筛选出白内障相关基因。 最新.课件 * （2）研究白内障相关基因的结构：…… （3）研究白内障相关基因在晶状体上皮细胞变化中的作用：…… 观察指标如下： ①存活细胞数；②光镜、透射电镜下细胞形态的变化；③细胞凋亡检测：用原位末端